氨基糖苷类的抗菌机制主要是抑制细菌蛋白质的合成，并且还能破坏细菌细胞膜的完整性。
在抑制细菌蛋白质合成方面，氨基糖苷类首先通过离子吸附作用附着于细菌细胞膜，这有助于药物进一步进入细菌细胞内。它们可以作用于细菌核糖体的多个环节。一方面，氨基糖苷类能与细菌核糖体30S亚基结合，抑制起始复合物的形成，使得mRNA不能与核糖体正确结合，从而阻碍了蛋白质合成的起始阶段。另一方面，这类药物还会引起mRNA密码的错读，导致错误的氨基酸被掺入到肽链中，合成无功能的蛋白质。而且，氨基糖苷类能够抑制肽链的释放，使合成的肽链不能从核糖体上释放出来，最终造成细菌体内核糖体的耗竭，无法正常合成有功能的蛋白质，影响细菌的生长和繁殖。
在破坏细菌细胞膜完整性方面，氨基糖苷类可以与细菌细胞膜上的磷脂结合，使细胞膜的通透性增加。这会导致细胞内的重要物质如钾离子、核苷酸等外漏，破坏了细菌细胞内的物质平衡，最终导致细菌死亡。此外，细胞膜完整性的破坏也使得更多的氨基糖苷类药物能够进入细菌细胞内，进一步增强其对细菌蛋白质合成的抑制作用。正是通过抑制细菌蛋白质合成和破坏细胞膜完整性这两个主要机制，氨基糖苷类展现出强大的抗菌活性。
