首先是脂肪酸的活化。脂肪酸在进入细胞后，需要先被活化成脂酰 - CoA。这一过程发生在胞液中，由脂酰 - CoA 合成酶催化，ATP 提供能量并分解为 AMP 和焦磷酸。活化后的脂酰 - CoA 不仅增加了脂肪酸的活性，还能提高其水溶性，为后续的氧化过程做好准备。
接着是脂酰 - CoA 进入线粒体。由于催化脂肪酸氧化的酶系存在于线粒体基质内，而活化的脂酰 - CoA 不能直接透过线粒体内膜，所以需要肉碱的转运。脂酰 - CoA 在肉碱脂酰转移酶Ⅰ的催化下，将脂酰基转移到肉碱上形成脂酰肉碱，然后通过线粒体内膜上的载体转运进入线粒体基质，之后在肉碱脂酰转移酶Ⅱ的作用下，脂酰基又转移到 CoA 上，重新生成脂酰 - CoA。
然后进入β - 氧化的核心步骤。脂酰 - CoA 在线粒体基质中进行β - 氧化，这是一个循环过程，每一轮循环包括四个连续的反应： 1. 脱氢：脂酰 - CoA 在脂酰 - CoA 脱氢酶的催化下，在α和β碳原子之间脱氢，生成反Δ² - 烯脂酰 - CoA，同时产生 FADH₂。 2. 加水：反Δ² - 烯脂酰 - CoA 在烯酰 - CoA 水化酶的催化下，加水生成 L( )-β - 羟脂酰 - CoA。 3. 再脱氢：L( )-β - 羟脂酰 - CoA 在β - 羟脂酰 - CoA 脱氢酶的催化下，再次脱氢生成β - 酮脂酰 - CoA，同时产生 NADH H⁺。 4. 硫解：β - 酮脂酰 - CoA 在β - 酮硫解酶的催化下，与 CoA 作用，使碳链在β位断裂，生成 1 分子乙酰 - CoA 和比原来少 2 个碳原子的脂酰 - CoA。
