氧化磷酸化是指在生物氧化过程中，代谢物脱下的氢经呼吸链氧化生成水时，所释放出的能量逐步驱动ADP磷酸化生成ATP的过程，其生成ATP的机制主要通过化学渗透假说和ATP合酶的作用来实现。
首先是呼吸链电子传递与质子泵出。代谢物如丙酮酸、异柠檬酸等在脱氢酶的作用下脱下氢，氢以质子（H⁺）和电子（e⁻）的形式存在。电子通过呼吸链中的一系列电子传递体，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）、黄素蛋白、铁硫蛋白、泛醌和细胞色素等，按一定顺序逐步传递。在电子传递过程中，复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ具有质子泵功能，它们将质子从线粒体基质泵到线粒体内膜外，形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度，包括质子浓度梯度（膜外H⁺浓度高于膜内）和电位梯度（膜外为正、膜内为负），这种梯度蕴藏着能量。
然后是质子回流驱动ATP合成。质子不能自由穿过线粒体内膜，只能通过ATP合酶回流到线粒体基质。ATP合酶由F₀和F₁两部分组成，F₀镶嵌在线粒体内膜中，形成质子通道，F₁则伸向线粒体基质。当质子顺浓度梯度经F₀回流到线粒体基质时，释放出的能量使F₁的构象发生改变。F₁具有催化ADP和Pi合成ATP的活性，在构象改变的过程中，ADP和Pi结合到F₁的活性中心，然后合成ATP并释放到线粒体基质中。
每2个电子经NADH氧化呼吸链传递，可驱动10个质子从线粒体基质泵到内膜外，能生成约2.5分子ATP；每2个电子经琥珀酸氧化呼吸链传递，可驱动6个质子从线粒体基质泵到内膜外，能生成约1.5分子ATP。通过氧化磷酸化这一高效的能量转换机制，细胞能够将营养物质氧化释放的能量转化为ATP中的高能磷酸键，为细胞的各种生命活动提供能量。
