脂肪酸的β-氧化过程主要发生在细胞的线粒体中。线粒体是细胞内重要的能量代谢中心，负责产生大部分细胞所需的ATP（三磷酸腺苷）。在这一过程中，长链脂肪酸首先需要通过肉碱穿梭系统从细胞质转运到线粒体内，在此它们被逐步分解成乙酰辅酶A分子，每一轮β-氧化循环可以产生一分子的FADH2和NADH，这两个高能电子载体随后进入呼吸链用于ATP的生成。此外，随着脂肪酸链逐渐变短，最终产物乙酰辅酶A还可以进入三羧酸循环进一步代谢。
值得注意的是，虽然大多数情况下脂肪酸β-氧化在线粒体中进行，但在某些特定条件下，如在过氧化物酶体内也可以发生短链和中链脂肪酸的β-氧化。不过，对于长链脂肪酸而言，线粒体是其主要的β-氧化场所。这一过程对维持机体能量平衡、特别是长时间饥饿或禁食状态下非常重要，因为此时脂肪组织中的脂肪会被动员出来作为能源物质供细胞利用。
