首先是脂肪酸的活化，这是脂肪酸氧化的第一步。脂肪酸在胞液中需要先被活化成脂酰 CoA 才能进入线粒体进行氧化。此过程由内质网、线粒体外膜上的脂酰 CoA 合成酶催化，在 ATP、CoA - SH、Mg2 存在的条件下，脂肪酸与 CoA - SH 结合，生成脂酰 CoA。这一反应消耗了 2 个高能磷酸键，相当于消耗了 2 分子 ATP。
然后是脂酰 CoA 进入线粒体。活化后的脂酰 CoA 必须进入线粒体才能被氧化，因为催化脂肪酸氧化的酶系都存在于线粒体基质中。长链脂酰 CoA 不能直接透过线粒体内膜，需要肉碱（L - β - 羟 - γ - 三甲氨基丁酸）作为载体转运。在肉碱脂酰转移酶Ⅰ的催化下，脂酰 CoA 与肉碱合成脂酰肉碱，后者在线粒体内膜肉碱 - 脂酰肉碱转位酶的作用下，通过内膜进入线粒体基质，接着在肉碱脂酰转移酶Ⅱ的催化下，脂酰肉碱转变为脂酰 CoA 并释放出肉碱。
接下来是进行β - 氧化过程。在线粒体基质中，脂酰 CoA 进行脱氢、加水、再脱氢和硫解四步连续反应。第一步脱氢反应，在脂酰 CoA 脱氢酶的催化下，脂酰 CoA 的α、β碳原子各脱去一个氢原子，生成反△2 烯酰 CoA，脱下的 2H 由 FAD 接受生成 FADH2。第二步加水反应，反△2 烯酰 CoA 在烯酰 CoA 水合酶的催化下，加水生成 L( )-β - 羟脂酰 CoA。第三步再脱氢反应，L( )-β - 羟脂酰 CoA 在β - 羟脂酰 CoA 脱氢酶的催化下，脱去 2H 生成β - 酮脂酰 CoA，脱下的 2H 由 NAD 接受生成 NADH H 。第四步硫解反应，β - 酮脂酰 CoA 在β - 酮硫解酶的催化下，加 CoA - SH 使
