胆碱酯酶药可分为胆碱酯酶抑制剂和胆碱酯酶复活剂，它们有着不同的作用机制。

胆碱酯酶抑制剂能抑制胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱（ACh）水解减少，从而导致突触间隙中ACh积聚，产生拟胆碱作用。根据其与胆碱酯酶结合后水解速度的快慢，可分为可逆性和不可逆性胆碱酯酶抑制剂。可逆性胆碱酯酶抑制剂，如新斯的明，它能与胆碱酯酶结合形成复合物，该复合物分解相对较快，使胆碱酯酶的活性在一定时间后可恢复。新斯的明通过抑制胆碱酯酶，使ACh在神经肌肉接头处堆积，增强并延长ACh的作用，能兴奋骨骼肌，可用于治疗重症肌无力；还能兴奋胃肠道和膀胱平滑肌，用于术后腹气胀和尿潴留等。不可逆性胆碱酯酶抑制剂，主要是有机磷酸酯类，它们与胆碱酯酶结合后形成难以水解的磷酰化胆碱酯酶，导致胆碱酯酶持久失活。有机磷酸酯类中毒时，会出现瞳孔缩小、流涎、腹痛、腹泻等M样症状，以及肌震颤等N样症状。

胆碱酯酶复活剂，如碘解磷定，其作用机制是与磷酰化胆碱酯酶中的磷酰基结合，使胆碱酯酶游离出来，恢复其水解ACh的活性。同时，碘解磷定也能直接与体内游离的有机磷酸酯类结合，形成无毒的磷酰化碘解磷定，由尿排出，阻止游离的有机磷酸酯类进一步与胆碱酯酶结合，从而起到解毒作用。不过，碘解磷定对不同的有机磷酸酯类中毒疗效存在差异，对形成不久的磷酰化胆碱酯酶有复活作用，但对中毒时间过久且已经“老化”的磷酰化胆碱酯酶则难以复活。