氯霉素的作用机制主要是通过抑制细菌蛋白质的合成来发挥抗菌作用。

细菌的蛋白质合成过程涉及多个关键步骤，而氯霉素能够特异性地作用于细菌核糖体的50S亚基。核糖体是细菌合成蛋白质的重要场所，它由大亚基（50S）和小亚基（30S）组成。在蛋白质合成过程中，氨基酸会在核糖体上按照mRNA的编码顺序依次连接形成多肽链。

氯霉素可以与细菌核糖体50S亚基的A位紧密结合，A位是新进入的氨酰 - tRNA结合的位点。当氯霉素结合到A位后，它会阻止氨酰 - tRNA进入该位点，从而阻断了肽链的延伸过程。因为肽链的延伸需要不断有新的氨酰 - tRNA携带氨基酸进入核糖体，与正在合成的肽链形成新的肽键。由于氯霉素的结合，使得这一过程无法顺利进行，细菌蛋白质的合成也就受到了抑制。

这种作用机制具有一定的选择性，氯霉素对细菌核糖体有较强的亲和力，而对哺乳动物细胞的核糖体影响相对较小。不过，它对某些哺乳动物细胞的线粒体核糖体也有一定的抑制作用，这可能是其产生一些不良反应的原因之一，比如可能会影响线粒体的功能，导致一些与线粒体相关的生理过程出现异常。

氯霉素通过抑制细菌蛋白质合成，使得细菌无法合成其生存和繁殖所必需的蛋白质，从而达到抑制细菌生长和繁殖的目的，发挥抗菌作用。它对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制作用，尤其对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强。