【摘要】  探讨益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的影响。方法：72只清洁级雄性SD大鼠，除8只作正常对照组外，其他大鼠在背部全层皮肤缺损开放性创面的基础上加造气虚血瘀证糖尿病模型后，随机分为模型组、贝复济组、益气化瘀组、益气组和化瘀组。应用免疫组织化学、图像分析等技术，观察各组大鼠创面肉芽组织中HIF-1α和VEGF水平的变化。结果：模型组HIF-1α水平高于正常对照组（ P <0.01），VEGF浓度明显低于正常对照组（ P <0.01）。各用药组HIF-1α表达水平明显低于模型组（ P <0.01），VEGF表达水平明显高于模型组（ P <0.01）。益气化瘀组HIF-1α表达水平明显低于贝复济组、益气组和化瘀组（ P <0.05或 P <0.01），VEGF表达水平明显高于贝复济组（ P <0.01）。益气组与化瘀组HIF-1α和VEGF的表达水平相似，它们与贝复济组之间无明显差异。结论：益气化瘀中药能明显促进糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠的创面愈合，其机制与下调HIF-1α水平、上调VEGF的表达水平和改善局部缺血缺氧状态有关。

　　【关键词】  糖尿病

　　我们在长期的临床实践中发现，益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡有显著的疗效［1］。为进一步探讨益气化瘀中药促进创面愈合的作用机制，开展了以下研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 72只雄性SD大鼠，清洁级，2月龄，体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。动物合格证号：医动字第02-22-2号。

　　1.2 药物 益气化瘀方由生黄芪、太子参、桃仁和地龙组成，剂量比例为2.5∶2.5∶1∶1.大鼠给药剂量为11.61 g/（kg.d），减压浓缩至含生药 2.5 g/ml； 拆方益气方由生黄芪和太子参组成，剂量比例为1∶1，大鼠给药剂量为6.75 g/（kg.d），减压浓缩至含生药1.5 g/ml；拆方化瘀方由桃仁和地龙组成，剂量比例为1∶1，大鼠给药剂量为 4.86 g/（kg.d）， 减压浓缩至含生药1.0 g/ml.以上中药均由上海中医药大学龙华医院制剂室按水煎醇沉工艺制备，4 ℃冰箱保存备用。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）贝复济，珠海东大生物制药有限公司产品。批号：国药准字S10980077.

　　1.3 主要实验试剂 免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin-biotin per-oxidase method， S-P）试剂盒，美国Zymed公司产品；EnVision试剂（HRP/Rabbit）即用型，丹麦Da-ko公司产品；缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α）、血管内皮细胞生长因子（vascu-lar endothelial growth factor， VEGF）一抗（兔抗鼠，分别1∶100、1∶50稀释），美国Santa Cruz公司产品；生物素标记的羊抗兔抗体，Vector公司产品；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记山羊抗小鼠抗体，北京中山生物技术有限公司产品。

　　1.4 主要实验仪器 IMS细胞图像分析系统和医学图像分析软件，上海申腾信息技术有限公司产品； 摄像机（型号：MV-CP410），Panasonic公司产品；显微镜，Olympus公司产品；BH2数码相机，Nikon公司产品。

　　1.5 糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠模型的建立 给大鼠喂饲高脂饲料（4%胆固醇，10%猪油， 0.2% 甲基硫氧嘧啶，0.5%胆酸钠，85.3%基础饲料）10 d后，以pH 4.6，0.1 mmol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素（streptozotocin， STZ），配成1%溶液，以60 mg/kg的剂量连续腹腔内注射STZ溶液2 d，72 h后动物血糖浓度大于16.7 mmol/L及尿糖为（++++）时，即成糖尿病气虚血瘀证大鼠模型。将大鼠用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后，造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径 15 mm 的图章标记造模面积，在无菌条件下，沿脊椎方向用外科方法作两条深达筋膜，直径为1.5 cm的创面，造成全层皮肤缺损开放性创面模型。加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定。造模后每只大鼠连续4 d后腿肌肉注射青霉素40万U［2～4］。

　　1.6 实验动物分组与给药方法 72 只大鼠先随机抽取8只为正常对照组，创面制作方法同前；其余64只大鼠建立糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证模型，造模过程中，未成糖尿病模型的7只，死亡3只。 54只 大鼠成模后再随机分为益气化瘀组（10只）、益气组（11只）、化瘀组（11只）、贝复济组（11只）、模型组（11只）。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1/5 000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃， 1次/d； 益气化瘀组、益气组、化瘀组外敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，1次/d；贝复济组外敷以贝复济浸透纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定，生理盐水灌胃，1次/d.连续用药7 d，停药后次日，分别将动物麻醉（氯胺酮）处死，取局部创面新生肉芽组织为所需实验样品。

　　1.7 HIF-1α和VEGF的检测

　　1.7.1 免疫组织化学S-P法 取各组大鼠创面新生肉芽组织，生理盐水清洗后，10%甲醛溶液固定。每组随机选取8个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水，浸蜡，包埋，连续切片。取4 μm石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水。PBS洗涤3次，3 min/次；3% H2O2室温20 min，PBS洗涤3次，3 min/次；将切片浸入0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波Ⅲ档（98 ℃）2次进行抗原修复，10 min/次，取出后在室温下自然冷却；滴加10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温 30 min； 滴加一抗（分别为上述抗体及相应抗体稀释度），4 ℃冰箱过夜；PBS洗涤3次，3 min/次；滴加生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min；PBS洗涤3次，3 min/次；Streptavidin-HRP 1∶200，37 ℃ 30 min；PBS洗涤3次，3 min/次；0.05% DAB+ 0.03% H 2O2显色8～12 min，流水洗；苏木素衬染，流水洗；吹干，常规树脂封片。检测以胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒者判定为阳性细胞，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

　　1.7.2 图像分析法 采用MV-CP410摄像机、IMS细胞图像分析系统，通过显微镜、图像采集卡、数码相机或CCD摄像机采集数字图像，数字图像为标准的BMP（位图）文件格式；在100倍显微镜下，先点击图像微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储 备用；消除免疫组化图像中的紫蓝色背景；选择阴性区域，处理后用蓝色表示；选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后用红色表示；测定图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值；每张切片随机选取3个视野，求出3个视野的平均值，计算HIF-1α和VEGF蛋白的表达水平。

　　1.8 统计学方法 所有实验数据采用SPSS 11.5软件进行数据分析，进行 t 检验或多个样本单因素方差分析（ q 检验）。

　　2 结果

　　模型组HIF-1α的表达水平明显高于正常对照组（ P <0.01），VEGF的表达水平明显低于正常对照组（ P <0.01）；除化瘀组，其他各用药组VEGF的表达水平均高于模型组，差异有统计学意义 （ P < 0.01）；其他各用药组HIF-1α的表达水平明显低于模型组（ P <0.01）；益气化瘀组HIF-1α的表达水平明显低于贝复济组、益气组和化瘀组（ P <0.01或 P <0.05），VEGF的表达水平明显高于贝复济组（ P <0.01），益气组和化瘀组HIF-1α和VEGF的表达水平与贝复济组比较，差异无统计学意义；益气组同化瘀组HIF-1α和VEGF的表达水平相似。见图1、图2和表1.

　　图1 各组大鼠创面肉芽组织HIF-1α表达（免疫组化S-P法， ×100）（略）

　　Figure 1 Expression of HIF-1α in granulation tissue on skin ulcer wound in rats （immunohistochemical S-P method， ×100）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： bFGF-treated group； D： Yiqi Huayu Recipe-treated group； E： Yiqi Recipe-treated group； F： Huayu Recipe-treated group.

　　图2 各组大鼠创面肉芽组织VEGF表达（免疫组化S-P法， ×100）（略）

　　Figure 2 Expression of VEGF in granulation tissue on skin ulcer wound in rats （immunohistochemical S-P method， ×100）

　　A： Normal control group； B： Untreated group； C： bFGF-treated group； D： Yiqi Huayu Recipe-treated group； E： Yiqi Recipe-treated group； F： Huayu Recipe-treated group.

　　表1 创面肉芽组织HIF-1α和VEGF表达（略）

　　Table 1 Expressions of HIF-1α and VEGF in granulation tissue on skin ulcer wound in rats

　　**P <0.01， vs normal control group；△P <0.05，△△P <0.01， vs bFGF-treated group；▲▲P <0.01， vs untreated group；□□P < 0.01， vs Yiqi Huayu Recipe-treated group.

　　3 讨论

　　糖尿病皮肤溃疡的发生、发展、变化是“因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损”的过程，其中“瘀”是在“虚”和“邪”的共同作用下产生，“邪”是在“虚”的基础上外侵。因而“虚”、“瘀”是糖尿病患者创面难以愈合的关键。所谓虚即全身营养不良，血液灌注不足，供血供氧不良，瘀即创面微循环的障碍。只有气血足、瘀滞祛除，才能断生腐之源，方能生肌长皮。据此，唐汉钧教授主张“祛瘀生新”，提出“祛瘀生肌”、“补虚生肌”理论。益气化瘀中药是由多年临床实践总结而成的，以生黄芪、太子参健脾益气，使气血充足，瘀毒移深就浅；桃仁、地龙养血和营通络，使血气通利，脉络畅通，推陈致新，符合糖尿病皮肤溃疡以“虚”、“瘀”为多见的临床特征，在临床已 取得了显著效果［1］。研究表明，糖尿病皮肤溃疡的发生、发展，主要是糖尿病患者高血糖、高血脂、高凝及高黏状态等引起的血管病变、神经病变、并发感染等多种因素共同作用的结果。血管病变导致血液循环障碍，局部组织呈慢性缺血、缺氧状态，直接影响溃疡愈合的程度及其预后，并且由于局部组织的缺血、缺氧，易于并发感染，导致溃疡发生且难以愈合［5，6］。缺血缺氧的病理环境可诱导HIF-1的产生。HIF-1是一种DNA结合性蛋白质分子，是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位构成的异源二聚体。HIF-1α须与HIF-1β在核内合成二聚体才有活性［7］，HIF-1α通过与靶基因的DNA结合位点结合作用于转录调控区，在上游水平调控30多种靶基因，如调控VEGF、内皮素-1、诱导型NO合酶、促红细胞生成素等的表达，从而促进新生血管的形成和血管重构，调节血管张力和改善血管通透性，增强糖酵解及血氧容量，使机体组织对缺血缺氧产生耐受与适应［8～13］，从而启动创面修复机制。此外，受HIF-1调节的VEGF是影响血管新生的关键生长因子之一［10］，是一种作用最强，且唯一特异性作用于血管内皮细胞的促进血管生成因子，它既可提高血管通透性，又可直接作用于血管内皮细胞，刺激其分裂增殖，诱导新生血管生成并影响微血管的量，从而促进创面的生长愈合。本研究结果表明，益气中药、化瘀中药均能在一定程度上改善局部的缺氧缺血状态，且两者无明显差异，印证了中医学“气能行血”的思想及我们提出的“益气助养肌生，化瘀利于肌生”的学术观点。而益气中药和化瘀中药合用，其作用尤为显著，印证了中医学“气血”理论，体现了中医相须配伍的科学性，是临床取得疗效的关键所在，也体现中医辨证论治的精华。总之，益气化瘀中药可通过下调HIF-1的表达水平、上调VEGF的表达水平，改善局部缺血缺氧状态，促使血管新生，从而促进创面愈合。

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