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膜结合细胞器和内膜系统的研究方法[细胞生物学]

2007-08-14 11:55 来源:医学教育网

  膜结合细胞器和内膜系统的研究方法

  虽然电子显微镜能够获得高度清晰的细胞内膜系统的结构,但是不能研究单个膜结合细胞器的结构和功能。离心分离技术、同位素示踪技术和突变技术是有效的研究内膜系统的方法。

  ■ 放射自显影术(autoradiography)

  胰腺系统中胰泡细胞具有最发达的内膜系统, 主要功能是合成消化酶类。这些酶类合成之后要从胰腺系统经由导管分泌到小肠中行使功能。这些酶是如何分泌出去的? Jamws Jamieson 和George Palade使用放射自显影技术证明了蛋白质分泌起始于内质网,经高尔基体到达细胞外。  

  ■ 差速离心分离与功能分析

  ● 微粒体(microsomes)分离

  虽然放射自显影技术证明了分泌蛋白合成的起始部位,但不能证明合成分泌蛋白的是何种细胞器。Albert Claude和Christian De Duve发展了细胞组份分离技术,分离到了具有蛋白质合成和分泌功能的结构。这些结构称为微粒体(图9-8)。

图9-8 通过差速离心分离微粒体

  用机械匀浆将细胞破碎,各种膜细胞器破碎,并且重新自我融合形成各种球形膜泡,通过较高速度离心除去细胞核、线粒体、过氧化物酶体等细胞器。收集悬浮液再用较低速度离心,然后用电子显微镜检查离心后分开的两部分结构。发现上层的囊泡表面是光滑的,沉淀下的囊泡表面有核糖体颗粒。

  ● 微粒体的功能研究

  通过差速离心分离的微粒体不仅保留了膜的结构特征,同时还具有活细胞中的生物活性和功能。如来自高尔基体的囊泡具有将蛋白质和脂进行糖基化修饰的作用。用从这些囊泡中分离的特殊蛋白作为抗原制备抗体,然后将制备的抗体与特定的颗粒如金颗粒结合,再通过免疫电镜技术就能够对用作抗原的酶进行定位,通过这些研究详细揭示了高尔基体在复杂的糖装配中的具体过程。

  ■ 用突变体研究内膜系统的功能

  为了研究编码与分泌途径相关蛋白的基因,科学家们筛选了一些突变体,在这些突变体中,内膜结构不正常。如获得的涉及ER出芽小泡形成基因发生突变酵母突变体的ER就特别大; 若是涉及与高尔基体融合的基因突变,这种酵母突变体中就会积累大量的分泌泡。通过对酵母突变体的研究, 揭示了小泡运输的过程(图9-9)。

图9-9 与分泌相关的不同酵母突变体

  野生型是分泌正常的酵母,A、B、C、D、E是五类不同的sec基因(secretory genes)突变,代表了蛋白质分泌的五个过程。A:分泌蛋白不能进入内质网,B: 内质网出芽缺陷,C:分泌小泡不能与高尔基体融合:D:高尔基体不能形成分泌泡;E:分泌泡不能与质膜融合。

  目前已经分离和克隆了几十个与分泌途径相关的基因,通过序列分析,表明这些基因与哺乳动物分泌基因具有同源性, 推测哺乳动物的细胞分泌过程与酵母相似。


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