一、结构特征与典型药物

　　苯骈二氮杂卓类药物为含氮杂原子、六元和七元环并合而成的有机化合物，其中1，4-苯骈二氮杂卓类药物是目前临床应用最广泛的镇静剂。因此，本节主要介绍该类药物的分析。

　　中国药典收载的品种有安定、硝基安定、艾司唑仑和氯氮卓（利眠宁）。95年版又增加了阿普唑仑、三唑仑、盐酸氟西泮、氯硝西泮和奥沙西泮等药物，并将安定和硝基安定更名为地西泮和硝西泮。上述药物除了氯氮卓外，均为地西泮的衍生物。从药品质量控制方法具有代表性出发，以下重点阐述地西泮、阿普唑仑和氯氮卓等药物的分析。典型药物的结构为：

　　地西泮阿普唑仑氯氮卓

　　本类药物结构中，二氮杂卓七元环上氮原子具有强的碱性，苯基并合后使碱性降低，致使含量测定需用非水溶液滴定法。本类药物的pKa值与其在不同pH介质中形成不同的分子形式（H2A+，HA，A-）有关，而分子形式影响其光谱特性，可利用此特性进行鉴别或含量测定。

　　本类药物结构中的环在强酸性溶液中可水解，形成相应的二苯甲酮衍生物，其水解产物所呈现的某些特性也可供鉴别或含量测定之用。

　　二、鉴别试验

　　（一）化学反应

　　1.沉淀反应

　　2.水解后重氮化-偶合反应氯氮卓、艾司唑仑和奥沙西泮的盐酸溶液（1→2），缓缓加热煮沸，放冷，加亚硝酸钠和碱性β-萘酚试液，生成橙红沉淀，而后者放置色渐变暗。

　　3.硫酸-荧光反应苯骈二氮杂卓类药物溶于硫酸后，在紫外光（365nm）下，呈现不同颜色的荧光。如地西泮为黄绿色；氯氮卓为黄色；艾司唑仑呈现亮绿色；硝西泮则显淡蓝色。若在稀硫酸中反应，其荧光颜色略有差别。

　　4.分解产物的反应上述列举的本类药物均为有机氯化合物，用氧瓶燃烧法破坏，生成氯化氢，以5%氢氧化钠溶液吸收，加硝酸酸化，显氯化物反应。中国药典仅用于地西泮和三唑仑药物的鉴别。

　　（二）紫外和红外吸收光谱

　　（三）薄层色谱法

　　苯骈二氮杂卓类药物发展很快，目前临床应用的品种不断增多。由于本类药物结构相似，不易分离、鉴别，因此薄层色谱法常被用于本类药物的系统鉴别。

　　1.常用的五种苯骈二氮杂卓类药物的TLC法按常规法点样10μl于硅胶G薄层板上，以苯-丙酮（3：2）展开剂，饱和15min，用上行法展开15cm，挥散溶剂，用稀硫酸喷雾，于105℃干燥30min，置紫外灯下检视荧光斑点，结果见表。

　　2.酸水解产物的TLC法利用苯并二氮杂桌类药物经酸水解产生的二苯甲酮衍生物进行鉴别。由于不同的苯骈二氮杂桌类药物水解后可能会获得相同的二苯甲酮衍生物，因此本法的专属性较差。但有的如三唑仑、阿普唑仑等，经酸水解后不产生二苯甲酮的衍生物。利用这特点，本法可用于体液中本类药物的鉴别。

　　三、有关物质和降解产物的检查

　　苯骈二氮杂卓类药物由于生产工艺过程或贮藏期间出现分解，致使药物中存在中间体、副产物等杂质（有关物质）和降解产物。目前国内外药典多采用薄层色谱法进行有关物质和降解产物的检查。而用高效液相色谱法，检查本类药物质量的报道，也在逐年增多。

　　四、含量测定

　　本类药物含量测定的法定方法为非水溶液滴定法、分光光度法。此外，还有比色法、荧光法和色谱法。现以药典收载的本类药物为例，简述其含量测定的方法。

　　（一）非水溶液滴定法

　　本法基于该类药物结构中，二氮杂卓七元杂环上氮原子的弱碱性，可用非水溶液滴定法测定其含量。由于该类药物的碱性强弱和存在状态不同，测定时所采用的溶剂、指示剂及指示终点的方法也不尽相同。测定的主要条件见表7-8.

　　（二）紫外分光光度法

　　药典收载的本类药物只有奥沙西泮原料药采用本法，但其他药物的制剂或片剂均匀度与溶出度的测定均采用此法。

　　（三）比色法

　　（四）高效液相色谱法

　　USP（23）：三唑仑和阿普唑仑的原料药及其制剂

　　我国药典：三唑仑原料药及地西泮注射液。地西泮注射液曾用萃取后分光光度法测定含量，因萃取不完全，有关物质和分解产物等对测定有干扰，故新版药典改用PHLC法。此法操作简便、可消除干扰（见色谱分离图7-7），注射液中地西泮的平均回收率为99.4%，相对标准偏差为0.8%.

　　1.地西泮注射液的HPLC法

　　色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（70：30）为流动相；检测波长为254nm.理论板数按地西泮峰计算应不低于1500，地西泮峰和内标物质峰的分离度应大于1.5.

　　内标溶液的制备取萘50mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　测定法取地西泮对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。吸取5～10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量（约相当于地西泮5mg），同法测定，按内标法以峰面积计算，即得。

　　2.三唑仑的HPLC法

　　3.RP-HPLC法测定血浆中地西泮浓度该法以艾司唑仑为内标，用氯仿-异丙醇混合溶剂提取，气流吹干，用甲醇溶解后进样，测定了剖腹产产妇及胎儿血浆中地西泮浓度。其回收率在92.86～98.77%之间；日内与日间精密度（RSD）分别为1.61～3.00%和2.18～5.18%.该法具有回收率高、专一性强、灵敏度高和重现性好等特点，并用此法对10名剖腹产产妇进行了血药浓度测定，为临床完全用药提供了依据。

　　（1）色谱条件：

　　色谱柱ZorboxODS250mm×4.6mm，预柱ZorboxODS250mm×4.6mm.柱温40℃。

　　流动相甲醇-水（70：30），流速为0.6ml/min。

　　检测器紫外检测器，检测波长为254nm。

　　（2）样品预处理：以2.00μg/ml艾司唑仑溶液为内标。取血浆1ml于10ml具塞离心管中，加入含碳酸钠、碳酸氢钠均为0.1g/ml的混合液200μl，旋涡混匀，加入提取液氯仿-异戊醇（98：2）6ml，旋混振荡0.5min×3次，3000r/min离心15min，吸取下层有机层5ml于另一试管中，气流吹干，残渣用1ml甲醇溶解，进样20μl.空白血浆提取液的色谱峰与地西泮、艾司唑仑血浆提取液的色谱峰分离较好。

　　（3）标准曲线制备：将均含艾司唑仑2.00μg/ml的0.125、0.25、0.500、1.00、2.00、4.00μg/ml地西泮标准液，不经提取直接进样20μl.结果以地西泮与艾司唑仑的峰面积比为Y，浓度为X，进行线性回归，回归方程为：Y＝1.3440X－0.0030，r＝0.9998。