多种口腔疾病或系统性疾病的发生、发展过程中，唾液成分的质和量都可能发生改变［1］。唾液蛋白作为唾液的主要有机成分，与唾液的多种生理功能密切相关［2］。因此研究唾液蛋白对于了解机体的生理及病理状况具有重要意义。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是常用的唾液蛋白的分离方法。传统的SDS-PAGE系统由Laemmli建立，该系统对分子量在20kD以下的蛋白分离欠佳［3］，需通过繁琐的操作制备梯度凝胶。而腮腺唾液的主要成分富脯蛋白和富组蛋白的分子量为10～40kD和3～5kD，故分析腮腺唾液蛋白需要对Laemmli的方法进行改进。既往研究发现经SDS-PAGE电泳后，唾液富脯蛋白难以着色。但可去除乙酸脱色液中的其他有机溶剂成分，使富脯蛋白发生变色效应呈紫红色，与其它蛋白区分［4］。
本实验旨在Laemmli方法的基础上，采用N-三羟甲基甘氨酸（Tricine）代替常用的甘氨酸，用Tricine-SDS-PAGE方法慢离子电泳分析腮腺唾液蛋白，探求适合于腮腺唾液蛋白分析的电泳方法，同时改进常规的染色方法，确定CBBR-250染色后紫红色区带和蓝色区带的数目，为进一步研究唾液蛋白提供方法学依据。
1.材料和方法
1.1 试剂Tricine购自Merck公司，聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂及蛋白质分子量标准品均为Gibco产品，其余试剂为国产分析纯。
1.2 腮腺唾液的收集和处理试验时，每隔20秒在舌尖部滴一滴2.5%柠檬酸以刺激唾液分泌。用仿制的Carlson-Crittenden装置收集禁食2小时后（上午10：00～12：00）的刺激性腮腺唾液。收集3ml唾液于刻度离心管内，然后取出100μl唾液，加入等体积2×SDS样品缓冲液，内含8%（0.28mol/L）SDS、24%（3.29mol/L）甘油、100mmol/LTris、4%（0.57mol/L）巯基乙醇及溴酚蓝，-30℃冰冻保存备用。依此法先后收集25名正常青年、7例牙龈炎及13例牙周炎患者腮腺唾液为样品。
1.3 腮腺唾液蛋白含量的测定蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）微板法［5］，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。医学教育网搜集整理
1.4 腮腺唾液蛋白的Tricine-SDS-PAGE分析参照Schgger等［3］的方法进行。电泳装置为Mini-proteanⅡ型电泳仪（Bio-rad产品），板胶厚0.75mm.分离胶浓度分别为16.5%和10%，浓缩胶浓度为4%.采用不连续缓冲系统，阳极缓冲液为0.2mol/LTris（pH8.9），阴极缓冲液为0.1mol/LTricine内含0.1%（3.47mmol/L）SDS和0.1mol/LTris（pH8.25），凝胶缓冲液为3mol/LTris内含0.3%（0.01mol/L）SDS（pH8.45）。唾液样品经40℃水浴30分钟后，在每样品池内加样15μl，于80V恒压电泳。电泳后，用两种染色方法处理凝胶。方法1：以含0.1%（1.2mmol/L）考马斯亮蓝R-250、40%乙醇、10%乙酸的染液染色7小时，10%乙酸脱色过夜。方法2：以含0.1%（1.2mmol/L）考马斯亮蓝R-250、46%甲醇、9%乙酸的染液染色7小时，以含10%乙酸、25%甲醇的脱色液脱色过夜。
2.结 果
腮腺唾液经16.5%Tricine-SDS-PAGE，CBBR-250染色，10%乙酸脱色，可分离出15条以上蛋白区带，分子量在3～100kD，其中有十多条呈紫红色的富脯蛋白区带（图1）。若脱色液中含有甲醇（方法2），则蓝色区带仍很明显，但未显现紫色区带（图2）。此外，从图1、图2还可以看到，不同个体蛋白区带的染色深浅不一，表明腮腺唾液蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图谱存在明显的个体差异。
图1 腮腺唾液16.5%Tricine-SDS-PAGE电泳图谱（染色方法一） LM：低分子量蛋白标准品，HM：高分子量蛋白标准品
图2 腮腺唾液16.5%Tricine-SDS-PAGE电泳图谱（染色方法二）
腮腺唾液经10%Tricine-SDS-PAGE分析，不同的染色方法得到的电泳图谱与16.5%的板胶相似，但对分子量在43kD以上的蛋白区带分离效果优于16.5%的板胶。
3.讨 论
Tricine-SDS-PAGE可使小分子量蛋白得到很好的分离，16.5%的Tricine-SDS-PAGE适于分离分子量在1～70kD的蛋白。本实验结果发现采用16.5%的Tricine-SDS-PAGE使主要的腮腺唾液蛋白都得到较好的分离。这与用5%～20%的梯度凝胶电泳结果相似［6］。而且通过调节凝胶浓度，也可使高分子量蛋白得到很好的分离。本实验采用的10%Tricine-SDS-PAGE对分子量在43kD以上的蛋白分离效果好。由于电泳系统内没有尿素和甘氨酸，不会影响蛋白质氨基酸序列的测定。医学教育网搜集整理
本实验采用两种染色方法对电泳后的凝胶进行处理，发现CBBR-250染色，10%乙酸脱色，可以清晰地显现紫红色的富脯蛋白区带，而脱色液中含有甲醇的方法只显出蓝色区带。本实验进一步证实了Beeley等的观点。富脯蛋白的这种变色效应与CBBR-250和富脯蛋白的特殊结构有关［6］。
本实验结果表明不同个体之间唾液蛋白存在明显差异。牙周病患者与正常个体腮腺唾液蛋白Tricine-SDS-PAGE电泳图谱的差别是由疾病所致还是个体差异的缘故，有待进一步研究。
本实验采用的Tricine-SDS-PAGE方法分析腮腺唾液蛋白，操作简便，不必对唾液样品进行脱盐、浓缩等处理，可直接加样，样品用量少，分辨率高，尤其适合于小分子量蛋白的分离。此方法还可以应用于全唾液及颌下腺-舌下腺唾液蛋白的分离纯化。
作者单位：郭 颖 罗海燕 杨美薷 华西医科大学口腔医学院 610041黄 宁 吴 琦 王伯瑶 华西医科大学感染与免疫研究室
参考文献
1 MandelID.Thediagnosticusesofsaliva.JOralPatholMed，1990，19（3）：119～125 2 杨萍综述。唾液蛋白质的研究进展。国外医学口腔医学分册，1993，20（2）：78～82 3 SchggerH，JagowG.Tricine-sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresisfortheseparationofproteinsintherangefrom1to100kDa.AnalBiochem，1987，166：368～379 4 BeeleyJA.Clinicalapplicationsofelectrophoresisofhumansalivaryproteins.JChromatogr，1991，569：261～280 5 李成文主编。现代免疫化学技术。北京：军事医学科学院微生物流行病研究所出版社，1990：6 6 BeeleyJA，SweeneyD，LindsayJC，etal.Sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresisofhumanparotidsalivaryproteins.Electrophoresis，1991，12：1032～1041
