易逆性抗胆碱酯酶药的作用机制主要围绕其与胆碱酯酶（ChE）的相互作用展开。胆碱酯酶能够迅速水解乙酰胆碱（ACh），从而终止其生理效应。易逆性抗胆碱酯酶药可与胆碱酯酶结合，但其结合过程具有可逆性。
此类药物分子结构中通常含有带正电荷的季铵基团和酯结构。以新斯的明为例，其季铵阳离子能以静电引力与胆碱酯酶的阴离子部位相结合，同时其分子中的羰基碳与胆碱酯酶酯解部位的丝氨酸羟基形成共价键，生成药物 - 胆碱酯酶复合物。
该复合物进而裂解，生成乙酰化胆碱酯酶和药物代谢产物。不过，这个乙酰化过程相较于乙酰胆碱被水解时形成的乙酰化胆碱酯酶要缓慢得多。而且，易逆性抗胆碱酯酶药形成的乙酰化胆碱酯酶能够在一段时间后自动水解，使胆碱酯酶恢复活性，这就是其“易逆性”的体现。
由于易逆性抗胆碱酯酶药抑制了胆碱酯酶的活性，使得乙酰胆碱的水解减少，突触间隙中乙酰胆碱的浓度升高。升高的乙酰胆碱可以激动胆碱能神经支配的效应器上的胆碱受体，产生一系列的药理作用。比如在骨骼肌，可增强骨骼肌收缩力；在胃肠道，能促进胃肠蠕动；在心血管系统，可导致心率减慢等。总之，易逆性抗胆碱酯酶药通过可逆性抑制胆碱酯酶，调节乙酰胆碱的浓度，从而发挥广泛的药理效应。
