在纯化抗血清时,去除杂蛋白是提高抗体特异性的重要步骤。以下是几种常用的方法:
1. 盐析法:通过改变溶液的离子强度来沉淀蛋白质,常用的有硫酸铵或硫酸钠。这种方法可以初步分离目标抗体与一些非目的性蛋白质。
2. 凝胶过滤层析:利用不同分子量大小的物质在多孔凝胶介质中移动速度的不同来进行分离。较小的分子会进入凝胶颗粒内部而较大的分子则主要沿外周流动,从而实现大小不同的蛋白分离开来。
3. 离子交换层析:基于蛋白质表面电荷差异进行分离的技术。选择合适的离子交换剂(如DEAE-纤维素或CM-纤维素),可以使带相反电荷的抗体优先结合到柱上,在洗脱过程中根据pH值和盐浓度的变化将目标蛋白与其他杂蛋白分开。
4. 亲和层析:利用抗原-抗体之间高度特异性的相互作用,将特定配体(如固定化的抗原)偶联到基质上制成亲和吸附剂。当含有多种成分的混合物通过此柱时,只有与该配体有高亲合力的目标蛋白会被捕获,其他杂蛋白则被洗脱掉。
5. 超滤法:利用半透膜对不同分子量大小物质的选择透过性来实现分离目的。对于相对分子质量较大的目标抗体来说,可以通过超滤去除小分子杂质和部分非特异性蛋白质。
6. 高效液相色谱(HPLC):这是一种高分辨率的层析技术,适用于微量样品的纯化。通过调整流动相组成、温度等条件可以实现对复杂混合物中各组分的有效分离。
在实际操作过程中,往往需要结合多种方法以达到最佳效果,并且每一步都需严格控制实验条件,确保最终获得高度纯净的目标抗体。