平板划线分离纯化是微生物学中常用的一种技术，用于从混合菌群中获得单个菌落，从而实现微生物的纯培养。其主要步骤如下：
1. 准备工作：首先确保所有操作都在无菌条件下进行。准备好已经灭菌的琼脂平板、接种环（或针）、待分离的细菌悬液等。
2. 灭菌处理：使用酒精灯火焰对金属接种工具进行灼烧消毒，以杀死可能存在的杂菌。
3. 取样：将冷却后的接种环伸入装有目标微生物样本的试管中，轻轻挑取少量样品（注意不要触碰容器壁或底部）。
4. 初次划线：打开平板盖子约1/3左右，使接种环接触琼脂表面，在一侧边缘处平行地进行数次直线划动。此步骤目的是将菌液均匀分布于小区域内。
5. 稀释划线：关闭平板盖后，再次通过火焰灭菌接种环。待其冷却后，在初次划线区域旁边的不同位置上继续做几条与之前垂直方向的划线。每次换新方向前都要重新灼烧并冷却接种工具以减少交叉污染。
6. 重复稀释步骤：根据需要可多次执行上述5中的操作，逐渐增加划线间距，使细菌数量进一步分散开来。
7. 培养：将平板倒置放入37℃恒温培养箱中，通常情况下过夜即可观察到单个菌落形成。
8. 挑取纯化后的菌落：从平板上选择形态一致、大小适中的单一菌落进行后续实验或保存。

通过上述步骤可以有效地实现细菌的分离与纯化。需要注意的是，在整个过程中要严格遵守无菌操作规范，避免外界微生物污染。