革兰染色是细菌学中非常重要的一种鉴别染色方法，其步骤顺序如下：

首先是涂片制备。取一块洁净的载玻片，用接种环挑取适量的待检细菌培养物，均匀地涂抹在载玻片上，涂成直径约1cm大小的薄膜。涂抹时要注意细菌的浓度适中，不宜过厚或过薄。涂好后让涂片自然干燥，也可以在酒精灯火焰上方稍微加热，以加速干燥，但要注意防止标本烤焦。干燥后的涂片需要进行固定，将载玻片迅速通过酒精灯火焰2 - 3次，使细菌牢固地附着在载玻片上，固定的目的是杀死细菌，同时使细菌蛋白质凝固，增加其对染料的亲和力。

然后进行初染。将结晶紫染液滴加在已固定的涂片上，覆盖整个标本区域，染色1分钟。结晶紫是一种碱性染料，它可以使细菌染上紫色。染色时间要严格控制，时间过短可能染色不充分，时间过长则可能导致背景颜色过深，影响观察。染色完成后，用细小的水流从载玻片一端缓慢冲洗，将多余的染液洗去，注意水流不要直接对着涂片冲，以免冲掉细菌。

接着是媒染。滴加卢戈碘液于涂片上，同样覆盖整个标本，作用1分钟。卢戈碘液作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成一种不溶性复合物，增强结晶紫与细菌的结合力，使染色更加牢固。1分钟后，用细小水流冲洗掉多余的碘液。

之后是脱色。这一步是革兰染色的关键步骤。用95%乙醇滴加在涂片上，轻轻晃动载玻片，使乙醇均匀地与涂片接触，脱色时间一般为20 - 30秒。乙醇具有溶解结晶紫 - 碘复合物的作用，革兰阳性菌由于细胞壁结构紧密，肽聚糖层厚，乙醇不易进入，所以结晶紫 - 碘复合物不易被溶出，仍保留紫色；而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，乙醇容易进入并将结晶紫 - 碘复合物溶出，从而使细菌脱色。脱色时间的控制非常重要，时间过短，革兰阴性菌可能脱色不彻底，仍呈现紫色；时间过长，革兰阳性菌也可能被过度脱色而呈现假阴性结果。脱色完成后，立即用细小水流