①基团影响:C11-酮基的反应速度快于C11-羟基甾体;C21-羟基酯化后较其母体羟基的反应速度慢;当酯化了的基团为三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯时,反应更慢。
②溶剂和水分的影响:含水量大时会使呈色速度减慢,但含水量不超过5%时,对结果几无影响,因此可采用95%乙醇。
③碱的种类及加入顺序的影响:在各类碱中,采用氢氧化四甲基铵能得到满意结果,故最为常用。以先加四氮唑盐溶液再加碱液较好。
④空气中氧及光线的影响:反应及其产物对光敏感,故应避光。
⑤温度与时间的影响:一般室温或30℃恒温条件下显色。中国药典多数医学教育|网收集整理25℃暗处反应40~45min.