1．通过观察、检测龙胆泻肝丸中马兜铃酸含量,与对大鼠急性肾功能损伤和形态学的影响，探讨龙胆泻肝丸降低肾毒性的作用。方法用含相当生药关木通3 g、6 g、12 g/（kg*d）的龙胆泻肝丸水煎液给大鼠连续灌胃7天,检测各组大鼠体质量、肾功能及肾组织形态学变化；并用RP-HPLC测定龙胆泻肝丸、关木通水煎液马兜铃酸含量.结果

① 龙胆泻肝丸水煎液组马兜铃酸含量明显低于关木通水煎液组（P<0.01）.

② 龙胆泻肝丸有减低关木通肾毒性作用。结论龙胆泻肝丸有降低关木通肾毒性作用，与马兜铃酸含量降低有关.

2．目前市售龙胆泻肝丸和含马兜铃酸药物如关木通等中药的安全性问题十分引人关注。本研究比较和评价了连续给予按近期中国药典生产的龙胆泻肝丸,关木通，三叶木通及五叶木通对小鼠所产生的毒性反应及程度,以提供木通类药物和龙胆泻肝丸的安全性资料，确定毒性剂量范围,为临床用药提供参考。方法龙胆泻肝丸、关木通、三叶木通及五叶木通对小鼠连续灌胃28d,观察小鼠的一般情况、进行血液生化学、病理组织学检查等。剩余1/2小鼠进行停药25d恢复期观察。结果龙胆泻肝丸组在整个试验期间未见明显的毒性反应，无毒性反应剂量为〉3.00g/（kg.d）。关木通的无毒性反应剂量为0.06g/（kg.d）；在〉=0.24g/（kg.d）时见体重增长缓慢,耗食量减少，肝、肾功能指标异常,高剂量组明显。病理观察可见明显的肾脏毒性，如肾近曲小管明显扩张,小管上皮细胞变性、坏死，肾间质炎症及明显的纤维化。肾脏病变停药后仍不能完全恢复。三叶木通和五叶木通组在整个试验期间未见与药物相关的毒性反应,无毒性反应剂量分别为0.40和〉10.00g/（kg.d）。结论在本试验条件下，关木通显示出明显的肾脏毒性,其出现毒性的剂量为0.24g/（kg.d），等于临床用量;而龙胆泻肝丸、三叶木通和五叶木通未见与药物相关的毒性反应,其无毒性反应剂量为临床用量的5-25倍。

3．本研究将根据中医临床肝胆湿热的主要客观表现，参考现代医学的胆汁淤积的形成机理，建立模拟肝胆湿热的动物模型，并对该模型的发病机理进行探讨。在该模型的基础上研究龙胆泻肝丸的治疗肝胆湿热的作用及其机理。目的：首先采用ANIT建立模拟中医临床的肝胆湿热模型，探讨该模型在胆汁转运代谢方面的分子机制。以该模型为基础，观察龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热的作用机理，探讨作用靶点，从而为龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热提供科学依据。

方法：

实验一、大鼠肝胆湿热模型的建立 将10只大鼠分为对照组和模型组，每组5只。模型组按100mg/kg的剂量一次性灌胃给予α-萘异硫氰酸酯（ANIT）花生油，对照组灌胃同体积花生油。造模后72h，大鼠一一行胆管插管术。收集4 h内的胆汁，按照收集的时间段计算胆汁分泌量。造模后76h检测血清总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆固醇（CHO）水平以及肝组织病理变化。此外，将另外5只大鼠分别于灌胃ANIT后12h、24h、48h、72h、96h分别处死一只。另取1只作为正常对照。分别于不同时间点，取出肝脏，提取肝组织总RNA，用RT-PCR方法检测MDR1b及MRP2 mRNA的表达。

实验二、观察龙胆泻肝丸（LD）对肝胆湿热模型大鼠和小鼠的清利肝胆作用 将72只大鼠分为6组，分别为对照组，模型组，胆乐胶囊（DL）组和LD 10、5.0、2.5g生药/kg剂量组。LD各剂量组和DL组每日给药1次，连续给药8天。对照组灌胃同体积花生油。于给药期间的第5天，除了对照组外，其余各组在给药后间隔1 h再灌胃给予ANIT 100 mg/kg（仅一次）。于第8天末次给药后30 min（末次给药前禁食24 h，不禁水），行胆管插管，收集4 h内的胆汁，按照收集的时间段计算胆汁分泌量。并检测血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、CHO、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平以及肝组织病理变化。另外72只小鼠按同样方法复制模型，最后检测血清TBIL、DBIL水平。

实验三、观察龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表达的影响 将20只大鼠分为4组，分别为对照组、模型组、LD 5.0、2.5 g生药/kg剂量组。给药组均于动物处死前8天开始给药，每日灌胃给药1次，连续8天。对照组和模型组灌胃同体积的蒸馏水。其中第5天给药1h后，除对照组给予花生油灌胃外，其他各组大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天取出肝脏。提取总RNA，RT-PCR检测MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2 mRNA的表达。

实验四、观察龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠中性粒细胞CD18表达的影响 将20只大鼠分为4组，分别为对照组、模型组、LD 5.0、2.5 g生药/kg。给药组均于动物处死前8天开始给药，每日灌胃给药1次，连续8天。对照组和模型组灌胃同体积的蒸馏水。其中第5天给药1h后，除对照组花生油灌胃外，其他各组大鼠按100mg/kg一次性灌胃ANIT花生油。第8天眼眶静脉取100μl抗凝血，加入PE标记的CD18抗体，流式细胞仪测中性粒细胞CD18表达，另取血20μl血细胞计数仪测白细胞及粒细胞总数。

结果：

实验一：大鼠肝胆湿热模型的建立结果显示，模型组给予ANIT 72h后，大鼠胆汁分泌量在胆管插管后4h内一直显著低于对照组（P0.05或P0.01），而血清TBIL、DBIL、CHO、ALT、AST、ALP水平明显高于对照组。组织形态学观察可见模型组出现肝细胞坏死和胆管损伤。对照组大鼠MDR1b mRNA无明显表达，MRP2 mRNA只有较弱表达。模型组大鼠在造模后48h～96h，MDR1b mRNA表达明显增强，但在造模后24h内表达不明显。造模后12h、24h，MRP2 mRNA表达较弱，而在造模后48h～96h均表达明显。

实验二：龙胆泻肝丸（LD）对肝胆湿热模型大鼠和小鼠的清利肝胆作用

1．胆汁分泌结果显示，模型组的胆汁分泌量较对照组显著降低（P0.05）。LD各给药组胆汁分泌量不同程度地高于模型组。LD 5.0g生药/kg组、LD2.5g生药/kg组在1h和1.5h时间点的胆汁排泌量较模型组显著增高（P0.05），其它时间点也有增高趋势，但无统计学意义。

2．血清TBIL、DBIL、CHO水平 模型组大鼠血清TBIL、DBIL、CHO水平均上升，与对照组比较有明显差异（P0.01）。而LD 5.0g生药/kg组、LD2.5g生药/kg组血清TBIL、DBIL、CHO与模型组比较有降低趋势，但无统计学意义。

3．血清ALT、AST、ALP 模型组大鼠血清ALT、AST、ALP升高，与对照组比较有明显差异（P0.01）。LD各剂量组的血清ALT、AST、ALP水平均与模型组比较无差异。

4．血清MDA、SOD、GSH水平 模型组大鼠血清MDA水平升高（与对照组比较P0.01），血清SOD及GSH水平与对照组比较无明显变化。LD各剂量组血清SOD、GSH水平与模型组比较无明显差异。LD对血清MDA有降低趋势（与对照组比较P0.05）。

5．肝脏组织形态学 各给药组肝细胞坏死不同程度的轻于模型组，其中LD 2.5g生药/kg组分别与模型组相比差异显著（P0.01）。

实验三：龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2表达的影响

1．肝组织MDR1a、MDR1b、MDR 2 mRNA表达模型组大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，肝组织MDR1a、MDR1b mRNA表达显著增加（P0.05，P0.01）。MDR2 mRNA也增加，但未达统计学意义。LD 5.0g生药/kg和LD 2.5g生药/kg对肝胆湿热模型大鼠的肝组织MDR1a、MDR1b、MDR2 mRNA表达无明显影响。

2．肝组织MRP1 mRNA和MRP2 mRNA表达模型组大鼠一次性灌胃ANIT 72h后，MRP2 mRNA表达下降，但与对照组相比无统计学意义。MRP1 mRNA的表达未见明显变化（P0.05）。LD 5.0g生药/kg和LD 2.5g生药/kg对肝胆湿热模型大鼠的肝组织MRP1、MRP2 mRNA表达无明显影响。

实验四：龙胆泻肝丸对肝胆湿热大鼠中性粒细胞CD18表达的影响 结果显示，LD各给药组白细胞总数以及粒细胞总数有下降趋势，CD18荧光强度明显低于模型组。

结论：通过以上实验，我们认为，通过灌胃ANIT，所建立的模型具有肝内、体内胆汁淤积，肝酶水平增高，肝细胞损伤等病理生理特征，与中医临床上以身目黄疸为主要表现的肝胆湿热证类似，可以作为肝胆湿热模型。该模型的肝脏组织中MDR及MRP mRNA表达发生变化，而MDR及MRP是与胆汁转运代谢有关的分子。说明MDR及MRP参与该肝胆湿热模型的形成。龙胆泻肝丸能增加胆汁流量，加速胆汁排出，但是对胆汁转运代谢分子MDR1a、MDR1b、MDR2、MRP1、MRP2等均无显著影响。结果提示，龙胆泻肝丸治疗肝胆湿热的作用机制可能与增加毛细胆管胆汁流量、减轻脂质过氧化反应、稳定细胞膜、阻抑CD11/CD18介导的中性粒细胞-内皮细胞粘附有关。