甘油三酯合成原料是由葡萄糖代谢提供的甘油及脂肪酸。甘油三酯合成的两条途径，一是小肠粘膜细胞内由消化吸收的甘油一酯及脂肪酸在转酰酶的催化下合成甘油三酯。二是在肝细胞及脂肪细胞进行的合成途径-甘油二酯途径。3-磷酸甘油在转酰酶的作用下，加上2分子脂酰CoA生成磷脂酸（phosphatidicacid）。后者在磷脂酸磷酸酶的作用下，水解脱去磷酸生成1，2-甘油二酯，然后在转酰酶的催化下，再加上1分子脂酰基即生成甘油三酯。

合成脂肪的三分子酸可为同一种脂肪酸，也可是三种不同的脂肪酸。合成所需的3-磷酸甘油主要由糖代谢提供。肝、肾等组织含有甘油激酶，能利用游离甘油，使之磷酸化生成3-磷酸甘油。脂肪细胞缺乏甘油激酶因而不能利用甘油合成脂肪。