磺胺类药物的作用机制主要是通过抑制细菌生长所必需的一种酶——二氢叶酸合成酶，从而阻止细菌合成核酸和蛋白质。具体来说，磺胺类药物的结构与对氨基苯甲酸（PABA）相似，而PABA是细菌合成二氢叶酸的重要原料之一。二氢叶酸在细菌体内转化为四氢叶酸，后者作为一碳单位转移反应的辅酶，在DNA、RNA和蛋白质的生物合成过程中起着关键作用。
磺胺类药物通过与二氢叶酸合成酶结合，竞争性地抑制该酶对PABA的作用，导致细菌无法正常合成二氢叶酸。由于细菌自身不能利用外源性的叶酸，因此当二氢叶酸合成受阻时，细菌的生长和繁殖就会受到严重影响，最终达到抗菌的效果。
需要注意的是，哺乳动物细胞内的四氢叶酸主要来自于食物中的叶酸，不依赖于PABA途径合成，所以磺胺类药物对人体的影响较小。此外，为了提高疗效并减少耐药性的产生，临床应用时常将磺胺类药物与二氢叶酸还原酶抑制剂（如甲氧苄啶）联合使用，从而同时阻断细菌体内四氢叶酸的两条合成路径。
