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乙酰CoA具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。首先从CH3CO基上除去一个H+，生成的阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰CoA中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。该反应由柠檬酸合成酶催化，是很强的放能反应。

此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而ATP，NADH是此酶的抑制剂。