骨肿瘤最终诊断的完成有赖于组织学检查，通常经常活检术获取组织标本。活检术需要有经验的医生施行，要保证得到有诊断意义的组织。切口设计应照顾到后续手术，最低限度地减少肿瘤细胞的扩散及对邻近正常组织的污染，决不可认为活检术为小手术而轻率从之，取材应避开坏死区，多取几个部位。肿瘤的外围部分多为反应区，有时不足以作出肯定的诊断，但是，病理检查也有其局限性，如疲劳骨折、骨化肌炎容易误诊为骨肉瘤；甲状旁腺功能亢进时的棕色瘤易误诊为巨细胞瘤；软骨来源的肿瘤难以区分良恶性等。
某些肿瘤的诊断中，化验检查有一定的帮助，如成骨肉瘤患者硷性磷酸酶可以增高，多发性骨髓瘤患者可有盆血、尿本周氏蛋白阳性，棕色瘤患者有血钙、血磷异常等。
