奥硝唑主要在肝脏代谢，在体内主要以具有细胞毒作用的原药和具有细胞毒作用的中间代谢活性产物，作用于厌氧菌、阿米巴虫、贾滴虫和毛滴虫细胞的DNA，使其螺旋结构段裂或阻断其转录复制而至其死亡，达到抗菌抗原生质的目的。研究报道，奥硝唑对小鼠急性毒性实验表明，其LD50值，1420mg/kg（灌胃），1027mg/kg（腹腔注射）。长期毒性实验表明奥硝唑具有良好的耐受性，无致突变、致畸、致癌性，与乙醇元无不良相互作用，但在用药期间对精子活动性有抑制作用。停药后则自然恢复。
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