华法林钠片是双香豆素衍生物，化学结构为3-（a-苯基丙酮）-4-羟基香豆素。在试管内无抗凝血作用，主要在肝脏微粒体内抑制维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成。维生素K能促使维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的氨基末端谷氨酸羧基化转变成γ-羧基谷氨酸，羧基化能够促进维生素K依赖性凝血因子结合到磷脂表面，因此可以加速血液凝固。γ-羧基化需要还原型维生素K（维生素KH2）的参与。双香豆素通过抑制维生素K环氧化物还原酶的活性从而阻断维生素KH2的生成，进而抑制维生素K依赖性凝血因子的γ-羧基化作用。此外，维生素K拮抗剂可以抑制抗凝蛋白C和S的羧基化。

华法林的抗凝效应能被小剂量维生素K1（植物甲萘醌）所拮抗，大剂量维生素K1（通常大于5mg）可以抵抗华法林的作用达一周以上，因为聚集在肝脏的维生素K1可以通过旁路而被维生素K环氧化物还原酶所还原。

华法林也可以干扰在骨中合成的γ-羧基谷氨酸蛋白的羧基化。孕期妇女接受华法林治疗可导致胎儿严重的骨骼发育异常，但尚无证据表明成人或儿童应用华法林会直接影响骨代谢。

华法林通过抑制凝血因子的活化抑制新的血栓形成，限制血栓的扩大和延展，抑制在血栓的基础上形成新的血栓，抑制血栓脱落和栓塞的发生，有利于机体纤溶系统清除已经形成的血栓。华法林没有溶栓（化栓）的作用，使用华法林后血栓减小甚至消失是华法林在抑制新的血栓形成的同时，机体清除血栓的机制（纤溶）作用的结果。