方法名称： 甲氨蝶呤片－甲氨蝶呤－高效液相色谱法

应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定甲氨蝶呤片中甲氨蝶呤的含量。

本方法适用于甲氨蝶呤片。

方法原理： 供试品研细后，经流动相溶解并定量稀释，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长302nm处检测甲氨蝶呤的峰面积，计算出其含量。

试剂： 1. 乙腈

2. 7.0%枸橼酸溶液

3. 2.0%无水磷酸氢二钠溶液

仪器设备： 1. 仪器

1.1 高效液相色谱仪

1.2 色谱柱

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按甲氨蝶呤峰计算应不低于1000。

1.3 紫外吸收检测器

2. 色谱条件

2.1 流动相：乙腈 7.0%枸橼酸溶液 2.0%无水磷酸氢二钠溶液=10 10 80

2.2 检测波长：302nm

2.3 柱温：室温

试样制备： 1. 对照品溶液的制备

精密称取甲氨蝶呤对照品适量，加流动相溶解并定量稀释成每1mL中约含0.1mg的溶液，即为对照品溶液。

2. 供试品溶液的制备

取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于甲氨蝶呤2.5mg），置25mL量瓶中，加流动相20mL，超声处理使甲氨蝶呤溶解，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即为供试品溶液。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

操作步骤： 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长302nm处测定甲氨蝶呤（C20H22N8O5）的峰面积，计算出其含量。

参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005版，一部，p.120。