摘要目的：观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究，并探讨肌上皮细胞的组织发生。方法：采用组织块原代培养法，通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段，对不同时期大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。结果：肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞见于体外培养第3d.肌微丝及Actin阳性细胞分别最早出现于培养第6d和7d.此结果与体内研究结果相一致。结论：肌上皮细胞可能来源于上皮干细胞；体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。
关键词肌上皮细胞分化体外培养
目前，有关涎腺体外原代培养的研究很多，并建立了一些培养方法，但有关涎腺发育分化的体外研究甚少。本实验采用组织块原代培养法，通过相差显微镜、透射电镜及免疫组化染色等检测手段，对胚胎17、18、19、20、21d及生后1、5、10、15、20d大鼠颌下腺肌上皮细胞进行研究。其目的在于：（1）观察组织块原代培养法是否可用于涎腺肌上皮细胞发育分化的研究；（2） 其发育分化是否与体内研究同步；（3）探讨肌上皮细胞的组织发生。
材料与方法
一、实验动物
选用150～250g健康Wistar雄性和雌性大鼠使之交配，次日晨将雌鼠阴道分泌物涂片，查到精子之日即作为受孕之零日，从此日算起，至胚胎发育17d取出位于胎鼠颈部的颌下腺组织。
二、厚胶及薄胶的制备
1. 厚胶制备：取大鼠尾腱1g，剪碎，70%乙醇消毒，干燥，溶于1∶1000醋酸，消化，离心，上清用作储存液。厚胶的配制方法为：储存液：10×培养液∶0.34M∶NaOH=8∶1∶1.24孔板内预先放置处理好的盖片，把配好胶铺于其内。
2. 薄胶制备：按常规方法制备鼠尾胶原，用吸管将胶原均匀涂于培养瓶生长面的内壁。
三、组织块培养法
在无菌条件下，取胚胎17天大鼠颌下腺，剪碎至1mm3小块，将小块组织分别接种于预先放置的铺有厚胶或薄胶盖玻片的24孔板中。用含有10%小牛血清、10ng/ml EGF、5μg/ml胰岛素、50ng/ml氢化考地松、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液培养，37℃，含5%CO2培养箱中培养。
四、相差显微镜观察
每日用相差显微镜观察大鼠颌下腺上皮细胞生长情况。同时取相应天数生长良好的细胞进行电镜观察及免疫组化染色。
五、透射电镜观察
无菌条件下，取培养于厚胶上的颌下腺细胞，48h后取出细胞生长较好的盖玻片，定为胚胎17d，依次取出相对应于体内胚胎18、19、20、21d及出生后1、5、15、20d培养的大鼠颌下腺细胞，用2.5%戊二醛固定，常规脱水、包埋、定位、垂直于细胞表面切片、染色、透射电镜观察。
六、免疫组织化学染色
无菌条件下，取培养于薄胶上的颌下腺细胞。取片情况同电镜观察。固定于甲醇：丙酮（1∶1）溶液中，用特异性抗体肌动蛋白（Actin），采用ABC法进行免疫组化染色。
结果
一、相差显微镜观察
体外培养胚胎17d细胞，48h后可见上皮细胞长出，为多边形或圆形，连接成片，有较多圆形细胞具有核分裂现象。
二、透射电镜观察
电镜观察提示体外培养细胞发育比体内延迟24～36h.培养3～4d（相对应于体内胚胎18～19d），肌上皮样细胞出现。核大、不规则。胞浆内见一些球形线粒体和扩张的粗面内质网及具有活力的高尔基复合体。胞浆突少而短。同时出现含有分泌颗粒的腺上皮细胞。培养第6d，肌上皮细胞内可见少量肌微丝、吞饮小泡及丰富的粗面内质网和散在的线粒体，相邻细胞以胞浆突互相相嵌，连接较紧密（图1）。培养第7d，肌上皮细胞胞浆内可见肌微丝束及大量扩张的粗面内质网、线粒体、高尔基复合体及胞膜内侧的吞饮小泡。并在部分区域见到基底板样物。培养第11d，肌上皮细胞数量增加，肌微丝束数量增多。胞浆突细长、弯曲且有分支。培养第16d，肌上皮细胞胞浆内肌微丝明显增多，并可见密体出现。细胞器数目减少。培养第21d，肌上皮细胞内含大量肌微丝束，细胞核形态不规则，吞饮小泡增多，相邻细胞间桥粒数目增加，细胞连接紧密。培养第26d，肌上皮细胞胞浆内含有丰富的肌微丝束，沿细胞长轴分布，细胞器数量减少（图2）。在胚胎发育过程中，尚可见一些形态介于导管和肌上皮细胞之间的细胞。
图1 肌上皮样细胞培养第6天，电镜观
图2 肌上皮样细胞培养26天，电镜观
三、免疫组化染色
选用肌上皮细胞特异性的抗体Actin进行免疫组化染色。结果表明，生后1d最早出现Actin阳性细胞，细胞为短梭形，胞核较大，胞浆着色。该细胞数量少且呈弱阳性（图3）。生后15d，Actin阳性细胞明显增多（图4）。生后20d，Actin阳性细胞数量多，有些区域细胞聚集成团，呈强阳性反应。
图3 生后1天，Actin阳性肌上皮细胞
图4 生后15天，Actin阳性肌上皮细胞
讨论
体外培养第3d（相当于体内胚胎18d）的颌下腺上皮细胞，电镜下可见肌上皮样细胞及含有分泌颗粒的分泌细胞。培养第6d，肌上皮细胞胞浆内可见少量肌微丝，粗面内质网和较丰富的线粒体。培养第7d，免疫组化染色最早发现Actin阳性细胞。培养21d，肌上皮细胞数量明显增多，肌微丝数量也明显增加。培养第26d，肌上皮细胞数量多，胞浆内含有丰富的肌微丝，免疫组化染色显示肌上皮细胞聚集成团，且呈强阳性反应。Line和Archer［1］的免疫组化研究结果表明，actomyosin阳性细胞最初出现于生后1d.莜原正德［2］通过电镜观察，发现胚胎18d的大鼠颌下腺中可见肌上皮样细胞。胚胎21d和生后1天可见少量的微丝。王洁等［3］免疫电镜研究亦表明Actin在正常肌上皮中为阳性反应。 本研究的结果与他们的观察结果基本一致。且电镜观察与免疫组化染色结果相符，与我们体内研究结果相一致。说明体外组织块培养方法亦适用于细胞分化研究。
国外，体外胚胎发育的研究多采用器官培养方法。这样可以更接近体内的发育分化情况。Culter等［4］选用胚胎16天的大鼠颌下腺进行器官培养，观察到肌上皮细胞位于基底膜与腺上皮细胞之间，生长发育情况类似体内，只是比体内延迟24～36h.但器官培养要求较高的培养条件。因此，我们根据现有的条件，采用可促进细胞极性分化且较长时间生存的胶原胶，配合有利于上皮细胞生长的培养液，选用组织块培养法对大鼠颌下腺进行培养。由于培养的组织块是从供体获取后的首次培养，刚刚离体，生物性状尚未发生很大的变化，具有二倍体遗传性。在一定程度上保持其原有组织结构，有利于适应体外环境，上皮与间质可相互诱导，更易反映体内状态。且操作简便，适用于组织量较少的培养，如本实验采用的大鼠胚胎17d颌下腺组织，体积非常小，每个腺体体积仅为约1mm3.只是我们在实验中发现组织块法体外培养的细胞排列的方式不如器官培养那样接近体内。
本实验结果显示肌上皮细胞在体外培养时，多位于分泌性上皮细胞之间，以桥粒与分泌性上皮细胞相连。部分区域也可见肌上皮细胞直接与基底板样物接触。Cutler等［5］在培养大鼠颌下腺时可观察到基底板样物的存在。有研究表明肌上皮细胞可产生基底膜成分中的某些蛋白，如层连蛋白、IV型胶原、纤维粘连蛋白等［6］。Warburton等［7］研究结果表明肌上皮细胞和上皮细胞均可产生胶原（主要为IV型胶原），且肌上皮细胞胶原的产量是上皮细胞的5倍。这些细胞外基质的成份的表达和产生，是由细胞生长的底物所调节的。因此说明细胞周围的间质（如本实验采用的Ⅰ型胶原）可影响基底膜的合成和/或分解［8］。有研究将已出现分支形态但无腺细胞分化的大鼠颌下腺的始基在体外行器官培养，培养液中加入Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原抗体。结果表明所有这些抗体均抑制始基的形态的继续形成和腺细胞的分化，表明间质性胶原（Ⅰ，Ⅲ型）和基底膜胶原（Ⅳ型）在涎腺形态发生中均起重要调节作用［9］。
一般胚胎器官发生和细胞的分化是一个连续的过程，提示这两个过程发生的机制具有相关性。然而，器官发生并不限定细胞分化的表型。本实验观察肌上皮细胞的的发育分化也多属于此种情况，观察表明，腺体器官发生和细胞的分化是部分相关的，各自有独立的调控机制。
关于肌上皮细胞的来源目前尚有分歧，但越来越多的证据支持Brown等提出的序列分化模式。这主要是双潜能前体细胞的发现。Shirasuna［10］1986年发现在涎腺导管系统存在至少能双向分化的干细胞。本实验通过电镜观察，发现肌上皮细胞与分泌细胞是同时发生的，位于基底板内，并发现一些细胞其形态介于肌上皮细胞和导管细胞之间。有研究已克隆了这种中间细胞，认为可能为体外培养时上皮细胞向肌上皮细胞的分化阶段和体内的终末导管结构。故提示发育中的涎腺具有共同的上皮性干细胞可多向分化，可分化为肌上皮细胞、腺泡细胞和导管细胞。此推测与Tsukada T等的结论相同。
作者单位：长春市（130041）白求恩医科大学口腔医学院
参考文献
1.Line SE and FL Archer. The postnatal development of myoepithelial cells in the rat submandibular gland. Virchows Arch Ant B.Zellpath，1972，10：253
2.莜原正德。 づ シ ト 唾液腺筋上皮细胞の发生，分化，发育にする 电子显微镜的检索。 日本口腔科学杂志，1981，30：34
3.Cutler LS and AP Chaudhry. Differentiation of the myoepithelial cells of the rat submandibular gland in vivo and in vitro： an ultrastructural study. J Morphol，1973，140：343
4.王洁，吴奇光，孙开华等。 正常涎腺肌上皮细胞的免疫电镜研究。 口腔医学纵横，1994，10（4）：199
5.Cutler LS. Intercellular contacts at the epithelial-mesenchymal interface of the developing rat submandibular gland in vitro. J Embryol Exp Morphol 1977；39：71
6.Gusterson BA， Warburton MJ， Mitchell D， et al. Distribution of myoepithelial cells and basement membrane proteins in the normal breast and benign and malignant breast diseases. Cancer Res，1982，42：4763
7.Warburton MJ， Ferns SA， Hughes CM. Extracellular matrix control of collagen producction by rat mammary epithelial and myoepithelial-like cells in vitro. Cell Biol Int Rep，1988，12（5）：397
8.Grant DS， Leblond CP， Kleinman HK， et al. The incubation of laminin， collagen TV， and heparan sulfate proteoglycan at 35℃ yields basement membrane-like structures. J Cell Biol，1989，12（5）：397
9.Cutler LS， Gremski W. Epithelial-mesenchymal interactions in the development of salivary glands. Oral Biol and Med，1991，2（1）：1
10.Shirasuna K， watatani K， Morilka S， et al. Isolation and character of different clones including myoepithelial-like varints from a clonal neoplastic epithelial duct cell line of human salivary gland origin. Cancer Res，1986，46：1418
