异丙酚和硫喷妥钠对心肌内游离Ca2+浓度的影响

材料和方法

动物

出生2～3天的SD乳鼠32只，性别不限

方法

1.心肌细胞分离培养[1]

取出生2～3天乳鼠心脏，置于平衡液中，剪取心室部分，用平衡液淋洗3次，剪成1mm×1mm×1mm大小碎块，置于0.15%胰蛋白酶液15ml中消化10分钟，移取上清液至盛有100ml的1640培养液的烧瓶中，再加入胰蛋白酶消化液，重复6～7次。培养液离心（1000转/分）10分钟，弃上清液，加入1640培养液40ml，移至150ml培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中贴壁分离分化90分钟，培养液细胞计数，校正至1×106cells/ml，接种于6孔板，每孔置一玻片，使细胞直接接种到玻片上。隔天换培养液，培养7～9天后的细胞用于实验，

2.实验分组

（1）对照组：不加任何药物；

（2）实验组A：Fura-2/AM负载后，按表1加入实验用药孵育10分钟进行Ca2+测定；

（3）实验组B：加入实验用药孵育10分钟后，加KCl40mmol/L，1分钟后进行Ca2+测定。

表1 异丙酚和硫喷妥钠浓度(mmol.L－1)

3.Fura-2/AM负载与荧光测定[2]

用吸管吸掉培养液，贴在玻片上的细胞用HEPES缓冲液（NaCl1，KCl 5.4，CaCl2，1.2，MgCl2 1.2，HEPES10和葡萄糖5mmol/L）浸洗2次，然后在含有Fura-2/AM5μmol/L的HEPES缓冲液中孵育30分钟，孵育温度为37℃。孵育后，吸掉Fura-2/AM液，玻片再用HEPES液洗2次后，玻片置于荧光显微镜下的玻璃小槽中，采用德国UMSP30型分光光度计进行Ca2+测定，发射波长为500nm，激发光为汞灯，以波长340nm和380nm的紫外光激发获得荧光图象，细胞影像经计算机图象处理系统处理后，以R340/380的代表细胞内Ca2+荧光强度[3]。该荧光强度与Ca2+浓度成正比。采用同样方法研究KCl、异丙酚和硫喷妥钠对细胞内Ca2+浓度的影响，不同的是加药后需在37℃继续培养10分钟再进行测定，激动剂KCl加入1分钟即行测定。

4.统计学方法

所有数据均采用±s表示，统计分析采用方差分析和t检验，P<0.05为有统计学意义。

结果

一、异丙酚和硫喷妥钠对静息心肌细胞内游离Ca2+浓度的影响

浓度Ⅰ、Ⅱ的异丙酚和硫喷妥钠对静息心肌细胞内游离Ca2+浓度无明影响，浓度Ⅲ分别使静息细胞内Ca2+降低20.19%和27.49%(图1)。

图1 硫喷妥钠和异丙酚对静息心肌细胞内游离钙浓度的影响

Ⅰ：外科麻醉药血药浓度；Ⅱ：两倍血药浓度；Ⅲ：四倍血药浓度团体t检验，P<0.05

二、异丙酚和硫喷妥钠对KCl激发心肌细胞内Ca2+内流影响40mmol/L的KCl可使心肌细胞内Ca2+浓度较基础值升高50.8%，异丙酚和硫喷妥钠对高浓度KCl所激发Ca2+内流均有明显抑制，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ浓度异丙酚分别抑制15.48%、51.43%和61.74%；硫喷妥钠分别抑制35.24%、58.09%和74.52%(图2)。

图2 硫喷妥钠和异丙酚对KCl激发的心肌细胞钙内流的抑制程度对照组；Ⅰ：外科麻醉血药浓度；Ⅱ：两倍血药浓度；Ⅲ：四倍血药浓度

讨论

Ca2+在细胞生命活动中所起的重要作用是众所周知的，它调节着许多重要的细胞功能，如肌肉收缩、细胞运动、分泌功能、电兴奋、糖代谢、受精、细胞分化和增殖等。另外，在许多病理生理状态下，细胞内Ca2+水平大大增加，引起细胞功能的改变，甚至导致细胞死亡。因此，测定细胞内游离钙含量及其药物作用后的含量改变，有助于了解细胞功能的启动、加强或抑制，并可阐明药物作用的机制和环节。本研究采用Fura-2作为荧光探剂进行钙离子测定，它与钙离子结合后具有很高的荧光强度和测量敏感性，对胞浆钙的缓冲作用很小，F340代表与Ca2+结合的Fura-2数量，F380则表示未与Ca2+结合的Fura-2数量，用这两个光谱的荧光比值作为指标，不仅能提高测量的可靠性，而且可基本不受细胞密度及荧光探剂的影响[3～5]。

动物和临床研究已证实，静脉麻醉药对心肌收缩功能有不同程度的抑制，部分药物还可能产生新的或加重心肌缺血，其确切机制至今尚不完全清楚。本研究采用原代培养乳鼠心肌细胞，以Fura-2荧光指示剂负载，观察了异丙酚对静息心肌细胞内游离钙浓度和高浓度KCl激发引起的Ca2+内流的影响，并与硫喷妥钠进行比较。文献报道[6，7]，异丙酚和硫喷妥钠产生外科麻醉时的血药浓度分别为0.4mmol/L和4mmol/L，因此本实验将0.4mmol/L异丙酚和4mmol/L硫喷妥钠作为临床剂量组，并以浓度成倍递增，进行等效量比较。结果发现高浓度异丙酚和硫喷妥钠均使静息心肌细胞内游离钙明显减少。在实验中，我们选用40mmol/L的钙通道激动剂氯化钾改变细胞外环境，作为对照组，观察到细胞内钙离子浓度明显增加，这是由于钾离子引起细胞膜去极化而激活心肌细胞膜上的钙泵引起钙内流，而在预先加入不同浓度的异丙酚和硫喷妥钠孵育10分钟后，再加入40mmol/L的氯化钾，1分钟后进行测定，结果发现两组药物对KCl所激发Ca2+内流均有明显抑制，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ浓度异丙酚分别抑制15.48%、51.43%和61.74%；硫喷妥钠分别抑制35.24%、58.09%和74.52%（图2）。说明异丙酚和硫喷妥钠均可明显抑制心肌细胞兴奋时的钙内流，且硫喷妥钠抑制心肌细胞钙内流的程度大于异丙酚。

可见，降低心肌细胞内钙离子浓度，不仅仅是通过抑制电压依从性钙通道而影响钙内流，而且也可影响静息状态下钙的溢流过程。此结果提示，异丙酚和硫喷妥钠在完整心肌的负性肌力作用可能与其部分抑制兴奋-收缩耦联过程中钙离子内流和抑制静息状态下的钙溢流有关。