由于历史和时代的局限，《神农本草经》也存在一些缺陷，为了附会一年365日，书中收载的药物仅365种，而当时人们认识和使用的药物已远远不止这些。这365种药物被分为上、中、下三品，以应天、地、人三界，既不能反应药性，又不便于临床使用，这些明显地受到了天人合一思想的影响，而且在神仙不死观念的主导下，收入了服石、炼丹、修仙等内容，并把一些剧毒的矿物药如雄黄、水银等列为上品之首，认为长期服用有延年益寿的功效。这显然是荒谬的。此外，《神农本草经》很少涉及药物的具体产地，采收时间，炮制方法，品种鉴定等内容，这一缺陷直到《本草经集注》才得以克服。
《神农本草经》首次提出了“君臣佐使”的方剂理论，一直被后世方剂学所沿用，但在使用过程中，含义已渐渐演变，关于药物的配伍情况，书中概括为“单行”、“相须”、“相使”、“相畏”、“相恶”、“相反”、“相杀”七种，称为七情，指出了药物的配伍前提条件，认为有的药物合用，可以相互加强作用或抑制药物的毒性，因而宜配合使用，有的药物合用会使原有的药理作用减弱，或产生猛烈的副作用，这样的药应尽量避免同时使用。书中还指出了剂型对药物疗效的影响，丸、散、汤、膏适用于不同的药物或病症，违背了这些，就会影响药物的疗效。
