方法名称： 亚叶酸钙片－亚叶酸钙－高效液相色谱法

应用范围： 本方法采用高效液相色谱法测定亚叶酸钙片中亚叶酸钙的含量。本方法适用于亚叶酸钙片。

方法原理： 供试品加水溶解并定量稀释，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长280nm处检测亚叶酸钙的峰面积，计算出其含量。

试剂：1.甲醇

2.含0.1%四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液取10%四丁基氢氧化铵水溶液8.0mL和磷酸氢二钠2.2g加水溶解使成780mL，并用磷酸调节pH值至7.8。

仪器设备：

1.仪器

1.1 高效液相色谱仪

1.2 色谱柱

十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论塔板数按亚叶酸钙峰计算应不低于1000。

1.3 紫外吸收检测器

2.色谱条件

2.1 流动相：甲醇 含0.1%四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液=22 78

2.2 柱温：40℃

试样制备：1.含0.1%四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液取10%四丁基氢氧化铵水溶液8.0mL和磷酸氢二钠2.2g加水溶解使成780mL，并用磷酸调节pH值至7.8。

3. 对照品溶液的制备

精密称取亚叶酸钙对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.1mg的溶液，即为对照品溶液。

4. 供试品溶液的制备

取供试品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于亚叶酸20mg），置200mL量瓶中，加水适量，振摇，使亚叶酸钙溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，即为供试品溶液。

注：“精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。

操作步骤： 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10mL，注入高效液相色谱仪，用紫外吸收检测器于波长280nm处测定亚叶酸钙（C20H21CaN7O7·5H2O）的峰面积，计算出其含量，并将结果乘以0.9256。

参考文献： 中华人民共和国药典，国家药典委员会编，化学工业出版社，2005版，二部，p.187。