产生灭活酶：细菌产生灭活的抗菌药物酶使抗菌药物失活是耐药性产生的最重要机制之一，使抗菌药物作用于细菌之前即被酶破坏而失去抗菌作用。这些灭活酶可由质粒和染色体基因表达。β-内酰胺酶：由染色体或质粒介导。对β-内酰胺类抗生素耐药，使β-内酰胺环裂解而使该抗生素丧失抗菌作用。β-内酰胺酶的类型随着新抗生素在临床的应用迅速增长，详细机制见β-内酰胺类抗生素章。氨基苷类抗生素钝化酶：细菌在接触到氨基苷类抗生素后产生钝化酶使后者失去抗菌作用，常见的氨基苷类钝化酶有乙酰化酶、腺苷化酶和磷酸化酶，这些酶的基因经质粒介导合成，可以将乙酰基、腺苷酰基和磷酰基连接到氨基苷类的氨基或羟基上，是氨基甘类的结构改变而失去抗菌活性；其他酶类：细菌可产生氯霉素乙酰转移酶灭活氯霉素；产生酯酶灭活大环内酯类抗生素；金黄色葡糖球菌产生核苷转移酶灭活林可霉素。

抗菌药物作用靶位改变：由于改变了细胞内膜上与抗生素结合部位的靶蛋白，降低与抗生素的亲和力，使抗生素不能与其结合，导致抗菌的失败。如肺炎链球菌对青霉素的高度耐药就是通过此机制产生的；细菌与抗生素接触之后产生一种新的原来敏感菌没有的靶蛋白，使抗生素不能与新的靶蛋白结合，产生高度耐药。如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）比敏感的金黄色葡萄球菌的青霉素结合蛋白组成多个青霉素结合蛋白2a（PBP2a）；靶蛋白数量的增加，即使药物存在时仍有足够量的靶蛋白可以维持细菌的正常功能和形态，导致细菌继续生长、繁殖，从而对抗抗菌药物产生耐药。如肠球菌对β-内酰胺类的耐药性是既产生β-内酰胺酶又增加青霉素结合蛋白的量，同时降低青霉素结合与抗生素的亲和力，形成多重耐药机制。

改变细菌外膜通透性：很多光谱抗菌药都对铜绿假单胞菌无效或作用很弱，主要是抗菌药物不能进入铜绿假单胞菌菌体内，故产生天然耐药。细菌接触抗生素后，可以通过改变通道蛋白（porin）性质和数量来降低细菌的膜通透性而产生获得性耐药性。正常情况下细菌外膜的通道蛋白以OmpF和OmpC组成非特异性跨膜通道，允许抗生素等药物分子进入菌体，当细菌多次接触抗生素后，菌株发生突变，产生OmpF蛋白的结构基因失活而发生障碍，引起OmpF通道蛋白丢失，导致β-内酰胺类、喹诺酮类等药物进入菌体内减少。在铜绿假单胞菌还存在特异的OprD蛋白通道，该通道晕粗亚胺培南通过进入菌体，而当该蛋白通道丢失时，同样产生特异性耐药。

影响主动流出系统：某些细菌能将进入菌体的药物泵出体外，这种泵因需能量，故称主动流出系统（active efflux system）。由于这种主动流出系统的存在及它对抗菌药物选择性的特点，使大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌对四环素、氟喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素、β-内酰胺类产生多重耐药。细菌的流出系统由蛋白质组成，主要为膜蛋白。这些蛋白质来源于4个家族：①ABC家族（ATP-binding cassettes transporters）;②MF家族（major facilitator superfamily）;③RND家族（resistance-nodulation-division family）;④SMR家族（staphylococcal mulitdrug resistance family）。流出系统有三个蛋白组成，即转运子（efflux transporter）、附加蛋白（accessory protein）和外膜蛋白（outer membrane channel ），三者缺一不可，又称三联外排系统。外膜蛋白类似于通道蛋白，位于外膜（G-菌）或细胞壁（G+菌），是药物被泵出细胞的外膜通道。附加蛋白位于转运子与外膜蛋白之间，起桥梁作用，转运子位于胞浆膜，它起着泵的作用。