酶免技术常应用的酶有辣根过氧化酶和碱性磷酸酶，针对不同的酶，所作用的底物又是不同的。
1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，
在403nm波长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H202方便。
许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
2.碱性磷酸酶（AP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为100kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。
在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等医学教丨育网整理原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。
3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-半乳糖苷，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶。
