抗体纯化盐析法即饱和硫酸铵沉淀法是检验主任医师考试涉及到的重要知识点,医学教育网为了帮助大家复习,整理了相关内容,具体如下:
该纯化方法是基于在待纯化免疫血清中加入饱和硫酸铵溶液,由于抗体也是一种蛋白质,其在水溶液中的溶解度是由其本身携带的亲水基团数和电荷数决定的,当我们向抗血清中加入饱和硫酸铵溶液后,硫酸根离子和铵根离子与抗体竞争溶液中的水分子,因为硫酸根离子和铵根离子与抗体分子相比,具有更强的亲水性,因此抗体分子表面的水化膜被破坏,同时其暴露出来的带电基团被溶液中的盐离子所中和进而导致其溶解度大大降低,依据此原理从而将其从抗血清中分离。
具体实验步骤如下:
将5ml抗血清与0.01M PBS在离心管内等体积混合,向其中加入10ml饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置过夜。
将步骤a中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
将步骤b中离心后的沉淀用2ml 0.01M PBS 溶解,然后缓慢加入3ml 饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置2小时。
将步骤c中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
将步骤d中离心后的沉淀用1.65ml 0.01M PBS 溶解,然后缓慢加入3.35ml 饱和硫酸铵溶液,边滴加边摇匀,然后置于2到8摄氏度静置2小时。
将步骤e中的待分离物于离心机内离心,8000r/min离心15到20分钟,除上清。
将步骤f中离心后的沉淀用1ml 0.01M PBS 溶解, 转移到MD 14000透析袋内,用0.01 M PBS进行透析,透析4次以上,每次至少1小时以上。