采集尿液、脓汁、胆汁、分泌物或血液等，以直接涂片进行初步检查。直接涂片染色、镜检可见呈短链排列，卵圆形革兰阳性球菌。
分离培养后，挑取可疑菌落，进行涂片、染色、镜检、触酶试验、胆汁七叶苷试验和6.5%NaCl耐受试验，可鉴定到属。接种于含血平板，若含革兰阴性杆菌可选用选择鉴别培养基，常用叠氮胆汁七叶苷琼脂，可抑制革兰阴性菌生长，而肠球菌分解七叶苷为黑色菌落；35℃～37℃孵育24h后，形成灰白不透明、表面光滑、直径0.5～1mm大小的圆形菌落，血平板上为α溶血或不溶血。
要鉴定到种还需要进行必要的生化试验。对具有临床意义的肠球菌应进行体外药敏试验，一般要测试对β-内酰胺类，尤其是青霉素类（如青霉素、氨苄西林）、万古霉素和氨基糖甙类（如庆大霉素）的敏感性，耐万古霉素肠球菌国外检出率较国内高。根据对庆大霉素的敏感性水平，可将庆大霉素耐药的肠球菌分为庆大霉素高水平耐药及庆大霉素低水平耐药。同时也应对β-内酰胺酶进行测试。
