流行性出血热病原学诊断方法
D1 用单克隆抗体检查早期病人血液白细胞中EHF病毒抗原
D1.1 原理
流行性出血热病人发病早期不仅有短期的病毒血症，在其循环血液白细胞中也携带有EHF病毒抗原，可用免疫荧光法检出这种抗原。应用特异性单克隆抗体免疫荧光结合物的直接免疫荧光法检查病人白细胞特异性抗原，在病程5天内阳性率可达80％以上，有利于本病的早期诊断。
D1.2 材料
a）多孔载玻片，染色缸，微振荡器，荧光显微镜等同间接免疫荧光法。
b）白细胞分离液（聚蔗糖泛影葡胺溶液）。
c）0.02mol/L pH 7.4PBS。
d）无水丙酮。
e）EHF病毒单克隆抗体荧光素结合物（A25－1－FITC）。
f）伊文思蓝（Evans Blue）PBS液1∶3万。
D1.3 检测步骤
D1.3.1 病人血液白细胞的分离：静脉采取病人全血5mL，置于含肝素（125μg/mL）0.5mL的试管内，摇匀。将抗凝全血沿试管壁缓慢加入预先装有5mL白细胞分离液的试管内。1500r/min离心15min.此时从上至下分为四层：血浆、白细胞、白细胞分离液和红细胞。吸出白细胞层放入另一试管中，用PBS振洗二次，每次洗后用2500r/min离心5min，弃上清液，沉淀物加1mL1640液，即为压积总白细胞（包括淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞）悬液。
D1.3.2 白细胞抗原片的制备：取上述白细胞悬液，摇匀，滴加于多孔载玻片上，紫外线照射15min，冷风吹干，冷丙酮（4℃）固定20～30min，吹干即为白细胞抗原片。
D1.3.3 染色观察：取吹干的白细胞抗原片，加EHF病毒单克隆抗体荧光素结合物（用1∶3万伊文思蓝的PBS稀释到使用浓度），37℃水浴箱湿盒中孵育45min，取出，用PBS振洗3次，每次3～5min，蒸馏水漂洗一次，吹干后镜检。
D1.4 结果判断
荧光显微镜下查白细胞胞浆有颗粒性或团块状荧光，其亮度在“十”以上，而阴性对照无荧光反应时，即为阳性。
全视野细胞均有荧光颗粒为“＋＋＋＋”；
3/4视野细胞有荧光颗粒为“＋＋＋”；
2/4视野细胞有荧光颗粒为“＋＋”；
1/4视野细胞有荧光颗粒为“＋”；
多视野查不见细胞有荧光颗粒为“－”。
D1.5 意义
在白细胞中查见EHF抗原，可确诊为此病，因此时不能获100％阳性结果，可同时检查同份血标本特异性IgM抗体。
注：如用EHF病毒分型单克隆抗体荧光素结合物检查白细胞抗原片，可同时区分病人感染EHF病毒的型别。
D2 用EHF病毒核酸杂交探针检测早期病人血液白细胞中EHF病毒RNA
D2.1 原理
EHF病人外周白细胞携带有EHF病毒抗原，也能从白细胞中分离出血热病毒，说明白细胞中有病毒的复制，用特异性核酸探针可以检测到病毒RNA（根据碱基配对原理）。
D2.2 材料
a）一般材料试剂及检测步骤详见B1.2和B1.3。
b）洋地黄毒昔配体（Digoxigenin，Dig）DNA标记及检测试剂盒。
EcoR I PstI内切酶
Proteinase K
c）汉城病毒R22株R3cDNA克隆（在PUC18载体EcoR I切点插入）或Hantaan病毒S片段cDNA克隆或M片段cDNA克隆（在PBR322Pst I酶切位点插入）。
d）杂交缓冲液：50％甲酰胺，10％硫酸葡萄糖，1×Denhardt液，2×SSC，400μg/mL鱼精DNA。
e）20×SSC，800mL水中溶解175.3g氯化钠和88.2g柠檬酸钠，加数滴10mol/L氢氧化钠，调pH至7.0，加水至1000mL.按比例稀释成5×SSC，2×SSC等。
D2.3 检测步骤
a）Dig标记cDNA探针方法：
取EHFV R3（或HTN S或M）克隆cDNA，双链线状DNA3～10μg.95℃变性10min，置冰水中，然后加入：1μg变性cDNA（5μL），2μL六聚核苷酸混合物，2μLdNTP和Digoxigenin混合物，19μL蒸馏水，1μLKlenow，置37℃孵育过夜，加2μL0.2mol/LEDTA，加2μL4mol/L氯化锂及75μL乙醇，置-70℃至少30min或-20℃至少2h，12000r/min离心10min，70％冷乙醇漂洗一次，真空干燥后，加50μLTE液（10mmol/L和1mmol/L）（pH8.0）溶解，待用。
b）白细胞抗原片的制备及杂交：
1）白细胞悬液按D1.3.1方法制备。
2）白细胞片的制备：常规清洗载玻片置5×SSC和1×Denhardt混合液中37℃过夜或56℃干燥4h，蒸馏水漂洗一次，转入乙醇/冰乙酸（3∶1）混合液，放置20min，取出晾干备用。
白细胞滴于涂有聚乙烯醇的玻片上，56℃干烤2h，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，每次10min.经30％，60％，80％，95％，100％乙醇脱水，在每一溶液中保留3min，晾干后置含0.5％过氧化氢的无水甲醇中10min（去内源性酶），无水乙醇洗2次，每次5min.经94％，80％，74％，60％，30％的乙醇水溶液和PBS中水化及洗涤，置0.1mol/L盐酸中10min，PBS洗3次，置含0.01％TritionX－100PBS中1.5min，PBS洗3次，每次10min.用Proteinase溶液消化（0.5μg/mL）15min，PBS洗3次（PBS含2mg/mL甘氨酸），每次3min.用4％多聚甲醛固定5min，再按上法用PBS洗，最后在30％，80％，95％，100％乙醇溶液中脱水，每次3min.
c）杂交：
杂交液中按比例1μg/mL加入探针DNA，将杂交溶液加在载玻片孔内，用硅化盖玻片盖上，周围用胶泥封闭，在120℃干燥箱中变性5min，迅速移至冰水中冷却，然后置湿容器中42℃杂交45h，去除盖玻片，载玻片在2×SSC中洗2次，每次10min，0.2×SSC60℃条件下洗2次，每次10min，2×SSC洗10min及PBS中洗一次。
探针检测：切片放入含10％小牛血清缓冲液中，37℃ 10min，再在1∶25碱性磷酸酶标记的抗Digoxigenin抗体中2h，PBS洗3次，置入显色液中3h，甘油封片，普通显微镜检查。
D2.4 结果判断
以正常人白细胞标本为对照，可在白细胞胞浆中观察到明显的着色信号，即为杂交阳性。
D2.5 意义
白细胞杂交检测阳性的可以确诊为EHF病毒感染。
D3应用RT－PCR技术检测EHF病毒基因及进行基因分型
D3.1 原理
PCR技术（聚合酶链式反应）是利用双链DNA分子碱基配对原则，和在一定条件下（耐热TaqDNA聚合酶及特异性引物等）扩增DNA片段的体外方法。其过程与病毒DNA的天然复制过程类似。它的特异性是由两个人工合成的寡核苷酸引物的序列决定的。引物与待扩增片段两条链两端DNA序列分别互补，扩增片段末端由两引物5′端限定，它的实质是一个重复进行的热变性－复性（退火）延伸的温控循环过程。待扩DNA在变性温度下解链成两条单链模板，在复性温度下，引物与模板的两端分别复性（杂交－碱基配对），在延伸温度和单核昔酸存在的条件下，由TaqDNA聚合酶催化，引导引物的5′→3′端方向延伸合成新链。合成产物再变性又成为下一循环的模板。随着循环次数的增加，DNA产量呈指数上升。从理论上讲，20个循环后，产量应为220，而从微量基因材料（Pg水平）特异性扩增可达几百万倍（μg水平）。EHF病毒含RNA基因组，在进行PCR之前，需将其通过逆转录酶作用合成第一链cDNA（RT），然后按上述原理及方法进行扩增（PCR），故称RT－PCR.设计不同型病毒的引物对，可以分别准确扩增出不同的基因型病毒的基因产物，故可作病毒的分型检测。
D3.2 意义
此法可用来对出血热病毒基因的鉴定及分型，分型的结果与血清学（特别是空斑减少中和试验PRNT）的分型结果一致，且具有更高的敏感性及特异性。在实践中有的病毒基因cDNA可以同时用两型引物扩增，有的均不能扩增，这时应考虑其他基因型的存在。
