痰结核杆菌检查法（补充件）
痰结核菌检查应在生物安全工作台内或在装有过滤装置的向室外排风橱内进行。
B1 涂片检查方法
B1.1 直接涂片法
痰标本：留取深咳痰标本约3～5mL于广口容器中。用折断竹签等物挑取脓样痰液0.1mL.放入载玻片中央处，均匀涂抹成2cm×2.5cm的卵圆形痰膜，如图B1。
自然干燥后，染色镜检。
涂片必须使用清洁、无划痕的新载玻片，一张玻片涂一份标本，载玻片只使用一次。
B1.2 集菌痰涂法
痰标本，留取深咳痰标本或12～24h痰标本5～10L，于消毒处理的玻璃容器（约120mL）中，如痰量少且粘稠时加适量蒸馏水（不超过10mL），经高压蒸气灭菌器0.105MPa20～25min，冷却后供集菌涂片用。
B1.2.1 离心集菌涂片法：取上述处理后的痰液5～10mL（不超过10mL）入50mL离心管内，加蒸馏水至50mL，以3000r/min转速（1750g离心力），离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片，自然干燥后，染色镜检。
B1.2.2 漂浮集菌涂片法：取上述处理的痰液5～10mL入120mL容积的玻璃瓶中，加蒸馏水20～30mL（总量不超过瓶容积的三分之一），加二甲苯0.3mL，放振荡机上振荡10min（振荡机速率240次/min），取出平放台上，加蒸馏水满瓶口，静置10～15min，把标号的载玻片盖于瓶口上。放置15～20min，取下玻片平放台上，自然干燥后，染色镜检。
B1.3 染色方法
B1.3.1 抗酸染色法（Ziehl－Neelsen法）
B1.3.1.1 染色剂配制
B1.3.1.1.1 染色剂：取碱性复红8g，溶解于95％酒精100mL内，加5％石炭酸900mL，放置24h后过滤备用。
B1.3.1.1.2 脱色剂：5％盐酸酒精。
B1.3.1.1.3 复染剂：取亚甲蓝0.15g溶入95％酒精50mL，加蒸馏水至1000mL。
B1.3.1.2 染色步骤
B1.3.1.2.1 痰涂片火焰固定，平放染色架上。
B1.3.1.2.2 加染色剂盖满痰膜，微火加温至染液呈现蒸汽，去火焰，染色5～10min（勿使染液呈现干涸），水洗。
B1.3.1.2.3 加脱色剂盖满痰膜，脱色3～5min，至无红色，水洗。
B1.3.1.2.4 加复染剂盖满痰膜，直接涂片复染30s，集菌涂片复染1～3min，水洗，干后，镜检。
痰涂片染色质量要求，涂片染色后，肉眼观察痰膜呈淡蓝或蓝色，不得有红色斑块，痰膜脱落部分在10％以下。镜下所见，视野背景清晰。在100×物镜的视野内于淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色杆菌，其他细菌和细胞呈蓝色。
B1.3.1.3 镜检与报告
显微镜下（目镜10×，油镜100×）所见结果报告标准如下：
B1.3.1.3.1 镜下计数100个视野（观察时间不少于4min），未发现抗酸菌者继续观察至300个视野，仍未发现抗酸菌者报告抗酸菌阴性（一）。
B1.3.1.3.2 镜检100～300个视野找到抗酸杆菌1～2条者，报告抗酸杆菌可疑（±），或重新涂片或另留痰标本复查。
B1.3.1.3.3 镜检100个视野内找到抗酸杆菌3～9条者，报告抗酸杆菌阳性（1＋）。
B1.3.1.3.4 镜检10个视野内找到抗酸杆菌1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（2＋）。
B1.3.1.3.5 镜检每个视野内找到抗酸杆菌1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（3＋）。
B1.3.1.3.6 镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者，报告抗酸杆菌阳性（4＋）。
在痰涂片检查报告中应包括痰标本的性状和质量。
B1.3.1.4 质量控制要求
为保证痰涂片检查质量，应建立和健全室内、室间痰菌涂片检查质量控制制度。室内质控应包括痰标本收集、涂片、染色标准和镜检结果复核等，室内质控应每日进行，绘制质控图。痰涂片保存供上一级实验室质控检查。
室间质控由上一级实验室定期进行。
痰涂片镜检结果质量要求，痰涂片阴性符合率在95％以上，涂片阳性符合率在98％以上，总符合率在96.5％以上。"1＋"以上的阳性痰片不允许出现假阴性。
B1.3.2 荧光素染色法（金胺O法）
B1.3.2.1 染色剂配制
B1.3.2.1.1 染色剂：取金胺0.01g溶于95％酒精10mL内。加5％石炭酸至100mL。
B1.3.2.1.2 脱色剂：3％盐酸酒精。
B1.3.2.1.3 复染剂：0.5％高锰酸钾水溶液。
B1.3.2.2 染色步骤
B1.3.2.2.1 痰涂片火焰固定，平放染色架上。
B1.3.2.2.2 加染色剂盖满痰膜，染色10～15min，水洗。
B1.3.2.2.3 加脱色剂盖满痰膜，脱色3～5min，至无黄色，水洗。
B1.3.2.2.4 加复染剂盖满痰膜，染色2min，水洗。干后，镜检。
B1.3.2.3 镜检与报告
在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或银白色荧光。
荧光显微镜检查，20×物镜计数，40×物镜观察抗酸杆菌形态，也有用40×物镜计数，菌体形态清楚，判断准确。
荧光染色后应在24h内完成检查，需隔夜时，置痰涂片于暗处保存，次日完成检查。
荧光显微镜20×物镜镜检结果按下列标准报告：
B1.3.2.3.1 30视野内未发现抗酸杆菌，报告抗酸杆菌阴性（一）。
B1.3.2.3.2 30视野内发现抗酸杆菌1～9条，报告抗酸杆菌条数。应以抗酸染色法（见B1.3.1）复染或涂片复检结果报告之。
B1.3.2.3.3 30视野内发现抗酸杆菌10～100条，报告抗酸杆菌阳性（1＋）。
B1.3.2.3.4 平均每一视野内发现抗酸杆菌1～10条，报告抗酸杆菌阳性（2＋）。
B1.3.2.3.5 平均每一视野内发现抗酸杆菌11～200条，报告抗酸杆菌阳性（3＋）。
B1.3.2.3.6 平均每一视野内发现抗酸杆菌多于200条，报告抗酸杆菌阳性（4＋）。
B2 分枝杆菌培养方法
B2.1 培养基
B2.1.1 改良罗氏培养基
成分：
味精（谷氨酸钠95％以上） 7.2g
磷酸二氢钾 2.4g
硫酸镁 0.24g
柠檬酸镁 0.6g
甘油 12mL
蒸馏水 600mL
马铃薯淀粉 30g
全卵液 1000mL
2％孔雀绿 20mL
制备法：各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水锅内煮沸30～40min（其间不时摇动，防凝块），呈糊状，待冷后，加入经消毒纱布过滤的新鲜全卵液1000mL，混匀。加2％孔雀绿20mL，混匀，分装试管（18mm×180mm）。每一试管加培养基7mL，培养基斜面高度为培养基占试管底部的三分之二处为宜，置血清凝固器内凝固。
凝固器内温度至90℃时，放入分装试管，以摆放两层为宜。待凝固器内温度达85～90℃，计时，凝固1～1.5h后取出，放冷，无菌试验后放4℃冰箱备用，一个月内使用。
制备的培养基颜色鲜艳，表面光滑湿润，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
B2.1.2 丙酮酸钠培养基
成分同改良罗氏培养基，除去甘油，加丙酮酸钠1.6g，以10％氢氧化钠调pH7.2，加葡萄糖4g，其他同改良罗氏培养基制备法。
B2.1.3 酸性罗氏培养基
成分同改良罗氏培养基，把其中磷酸二氢钾增加至14g，其他同改良罗氏培养基制备法。
B2.1.4 3％小川培养基
成分：
磷酸二氢钾 3g
谷氨酸钠 1g
甘油 6mL
蒸馏水 100mL
全卵液 200mL
2％孔雀绿 6mL
制备方法，同改良罗氏培养基。
鸡卵消毒法：
新鲜鸡卵经自来水清洗，肥皂水刷洗干净，待干后以75％酒精擦拭消毒。在无菌操作下把卵液倒入已灭菌的有刻度搪瓷杯内，灭菌纱布过滤入培养基中，加2％孔雀绿，混匀分装、凝固。
B2.2 前处理方法
B2.2.1 碱处理法（用于酸性罗氏培养基和3％小川培养基）
B2.2.1.1 2％氢氧化钠，取2g氢氧化钠，溶于80mL蒸馏水内全溶后，加水至100mL。
B2.2.1.2 处理方法，取痰标本1mL加2％氢氧化钠2～4mL，室温30min，其间振荡2～3次，促痰液化。
B2.2.2 酸处理法（用于改良罗氏培养基和丙酮酸钠培养基）
B2.2.2.1 2％硫酸液，取浓硫酸2mL缓缓加入蒸馏水90mL内，加水至100mL。
B2.2.2.2 处理方法，取痰标本1mL加2％硫酸2～4mL，室温30min，其间振荡（或用碎痰器打碎痰液）2～3次，促痰液化。
B2.3 接种方法
取消化后痰液混匀，以灭菌刻度毛细吸管取0.1mL.缓缓均匀地接种每支培养基斜面上，每份痰标本接种二支培养基，接种毕，放37℃孵箱内培养。
B2.4 结果与报告
接种后应每周观察细菌生长情况，阳性生长经涂片染色验证后随时报告，培养至8周未见细菌生长，报告分枝杆菌培养阴性（如进行菌种鉴定，应于接种后3天、7天观察细菌生长情况，而后每周观察至8周）。
培养结果按下列标准报告：
培养8周未见菌落生长，报告分枝杆菌培养阴性（一）。
培养基斜面菌落生长20个以下，报告分枝杆菌阳性与菌落数。
培养基斜面菌落分散生长，占据斜面1/4以下者，报告分枝杆菌阳性（1＋）。
培养基斜面菌落分散生长，占据斜面1/2以下者，报告分枝杆菌培养阳性（2＋）。
培养基斜面菌落密集生长或部分融合，占据斜面3/4以下者，报告分枝杆菌阳性（3＋）。
培养基斜面菌落密集生长呈菌苔样分布，占据全斜面者，报告分枝杆菌阳性（4＋）。
B2.5 培养基污染情况报告
观察分枝杆菌生长情况时，发现非分支杆菌生长时，报告污染菌生长，污染率高于5％时，提示培养基制备中灭菌处理不佳或消化液处理不良，应认真检查操作程序。
污染菌程度按下列标准报告：
B2.5.1 污染菌生长占培养基斜面1/4以下者，报告（C1＋）。
B2.5.2 污染菌生长占培养基斜面1/2以下者，报告（C2＋）。
B2.5.3 污染菌生长占培养基斜面3/4以下者，报告（C3＋）。
B2.5.4 污染菌生长占培养基全斜面者，报告（C4＋）。
B2.5.5 培养基液化者，报告（LQ）。
