血清免疫学检查（补充件）

　　B1 间接荧光抗体试验（IFAT）

　　B1.1 抗原片制备常用食蟹猴疟原虫为代用抗原。以食蟹猴疟原虫感染恒河猴，待红细胞感染率超过2％，且多数原虫为裂殖体前期时取血，加肝素抗凝，经2000r/min离心15min，弃血浆，加5倍容积pH7.2的0.01mol/L磷酸盐缓冲盐水（PBS），混匀后再次离心，弃上清液，重复洗涤3～4次，将细胞沉淀物加PBS恢复至原血量后混匀成悬液，使厚血膜每个视野有5～8个裂殖体或大滋养体。取悬液约10μL置干净载玻片的一端，推制成6.0cm×1.5cm长条形亚厚血膜，置室温中晾干或吹干。用纸包装放在有干燥剂的密封器内。在-20℃有效期为1年，在4℃有效期为3个月。用体外培养的恶性疟原虫制备抗原片，应在红细胞感染率为4％以上且以裂殖体为主时收集培养原虫，制片方法同前。

　　B1.2 血样的采集、运送和保存血清、滤纸干血滴均可应用。前者由不加抗凝剂的全血分离获得，在4℃可作运送及短期保存，-20℃可保存2年左右，但应减少反复冻融，以免影响抗体活性。后者将滤纸切成10cm×2cm纸片，在滤纸上压出直径为1.2cm的圆形印迹，从受检者的耳垂或手指取血充满圆圈，其血量约为20μL（约相当血清10μL），编号后阴干，放入有干燥剂的密封塑料袋内，在4℃可保存半年，-20℃可保存2年。

　　B1.3 操作方法受试血清以pH7.2的0.01mol/L PBS作1∶10或1∶20稀释，或将滤纸干血滴血样部分剪碎，放在有0.1或0.2mL PBS的井内，在4℃浸泡过夜，即成相当于1∶10或1∶20的血清稀释液。对1∶10或1∶20稀释度反应阳性的血样，继续作倍比稀释（1∶40，1∶80…）进行检测，直至转为阴性。最后的阳性稀释度即为终点滴度。

　　从冰箱中取出的抗原片，立即用电风扇吹干或在回暖后打开塑料袋，用特种蜡笔将每张抗原片划分成若干小格，每小格加一个血样或一个滴度，每批试验均设参考阳性、阴性血清及PBs空白对照。加血清后即移入37℃湿盒，30min后取出，用PBS缓慢冲洗后放入有PBS的缸内浸5～10min，用蒸馏水冲洗后再晾干或吹干。然后逐格滴加PBS稀释的1∶10的抗人IgG荧光抗体（或按产品说明），置湿盒内37℃温育30min，然后按上述方法清洗、吹干，用荧光显微镜检查反应结果。

　　B1.4 反应标准以裂殖体及大滋养体胞浆的荧光强度及形态结构清晰程度区分：无荧光为-，荧光微弱、形态结构不清为±，荧光较弱、形态结构尚清楚为＋，根据荧光明亮度和结构清晰度的增加依次为＋＋和＋＋＋。一般以1∶20血清稀释度时十以上判为阳性。

　　B2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

　　B2.1 可溶性抗原按IFAT方法收集食蟹猴疟原虫，或在体外培养的恶性疟原虫红细胞感染率为4％～8％且以裂殖体为主时收集培养原虫，离心洗涤3～4次，吸取沉淀上层的褐色部分装入保存管内。如当时不制备抗原，可放液氮内保存。如立即制备则放入－20℃冰箱反复冻融3次，每次1h，离心洗除血红蛋白，收集黑褐色沉淀部分，加10倍量的pH7.4的0.01mol/L PBS，以150mA的电流强度冰浴超声3次，每次1min，间隔5min，10000r/min离心30min，上清液即为可溶性抗原。为了测得此抗原的适宜工作稀释度，在酶结合物的常用浓度及参考阳性、阴性血清1∶100稀释的条件下，将抗原从1∶50，1∶100……共10个浓度稀释，包被塑料板进行检测，选取参考阳性血清光密度（OD）值为1.0的抗原稀释度作抗原适宜浓度。并按常用量用细塑料管分装，置液氮保存。

　　B2.2 操作方法用pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原按工作浓度稀释包被聚苯乙烯板，每井200μL，在4℃过夜。次日倾去抗原液，用pH7.4PBS/吐温20（PBS/T）灌洗3次，每次5min.加入PBS/T按1∶100稀释的待检血清，每一样本加2井，每井200μL，于37℃放置2h.取出后按前述方法用PBS/T洗涤3次，待干。加入以PBS/T稀释的过氧化物酶标记的抗人IgG结合物（一般为1：1000），每井200μL，于37℃放置2h.按前述方法洗涤3次后待干。每井加入过氧化氢（H₂O₂）底物系统溶液〔邻苯二胺（OPD）10mg＋pH5.0柠檬酸－磷酸盐缓冲液25mL，用前加33％H₂O₂10μL，避光存放200μL，于37℃放置30min.每井再加入2mol/L硫酸50μL终止反应。

　　B2.3 反应标准用酶标专用比色计读取492nmOD值。取每一样本两孔的OD值的平均值。OD值测定前先以有1/5的2mol/L硫酸底物溶液校正零点。通常以OD值≥0.4为阳性阈值。为了便于比较和减少误差，每板应设参考阳性、阴性血清及PBS/T空白对照，并测OD值。以式（B1）对各个血样的OD值进行校正：

　　附溶液配制方法：

　　pH7.2 0.01mol/L PBS

　　KH₂PO₄　0.38g

　　Na₂HPO₄ 1.02g（或Na₂HPO₄·12H₂O 2.58g）

　　NaCl 8.0g

　　蒸馏水加至 1000mL

　　pH7.4 PBS/T

　　NaCl 8.0g

　　KH₂PO₄　0.2g

　　Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g

　　KCl 0.2g

　　吐温20 0.5mL

　　蒸馏水加至 1000mL

　　pH9.6碳酸盐缓冲液

　　Na₂CO₃ 1.59g

　　NaHCO₃ 2.93g　 蒸馏水加至 1000mL

　　VpH 5.0柠檬酸磷酸盐缓冲液

　　a.0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 35.8g/500mL蒸馏水

　　b.0.1mol/L柠檬酸 10.5g/500mL蒸馏水

　　取a257mL＋b243mL＋蒸馏水500mL混合。