流行性出血热血清学诊断方法
A1 应用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体
A1.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人μ链多克隆或单克隆抗体捕获待测血清中的IgM，然后加入特异性抗原和酶标特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体），加底物显色。显色程度与特异性抗体中的IgM抗体含量呈正相关。以待检血清与特异性抗原和阴性（对照）抗原反应OD值的比值，作为判定IgM抗体反应的标准。
A1.2 材料
a）聚苯乙烯塑料板：40孔或96孔板，U型。
b）可变微量加样器：20μL和100μL各一支。
c）抗人IgM（μ链）：鼠抗人IgM（μ链）单克隆抗体或羊抗人IgM（μ链）多克隆抗体。
d）抗原：阳性抗原：细胞培养EHFV灭活抗原或基因工程表达抗原；
阴性抗原：未接种病毒的细胞培养抗原或无外源基因的相应表达系统抗原。
e）抗IgM阴性或阳性对照血清。
f）辣根过氧化物酶－EHF单克隆抗体标记物（HRP－McAb）。
g）包被液：0.1mol pH9.6的碳酸盐缓冲液（Na2CO3）3.18g，NaHCO35.88g，加蒸馏水至1000mL.
h）洗涤液（×10）：0.2mol pH7.4 PBS－T（Na2HPO4·12H2O 51.6g，NaH2PO4·2H2O 8.7g，NaCl 76g，Tween－20 5mL，溶解至1000mL）高压后使用，临用前10倍稀释。
i）稀释液：上述10倍稀释的PBS－T液，含5％牛血清。
j）底物液：临用前取柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH5.0）（柠檬酸10.2g，Na2HPO4·12H2O 36.8g，加水至1000mL）。
k）终止液：2mol/LH2SO4。
A1.3 检测步骤
a）用0.1 molpH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗人IgM（μ链）单克隆抗体（或羊抗人IgM（μ链），包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL，4℃过夜（或37℃ 2h）。
b）弃去包被液，用洗涤液重复洗3次，甩干。
c）加待检血清：将血清用PBS－T液稀释100倍，分别加入2反应孔，每孔100μL（如需设阳性和阴性血清对照亦同此法处理），37℃ 1h。
d）弃去血清，用洗涤液重复洗5次，甩干。
e）加阳性抗原及阴性抗原：将阳性抗原用稀释液稀释至适当工作浓度，加入其中一反应孔100μL；阴性抗原同样稀释，加入另一反应孔，37℃水浴孵育2h或者置4℃过夜（效果更优）。
f）弃去抗原，用洗涤液重复洗5次，甩干。
g）加HRP－MCAb：将HRp－McAb用稀释液稀释至工作浓度，每孔加入100μL37℃1h。
h）弃去标记物，用洗涤液洗5次，甩干。
i）显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液。放在室温暗处显色。
j）当观察到阳性抗原（或血清）对照显黄色而阴性抗原（或血清）对照为无色后，每孔加入50μL2mol/L H2SO4终止反应。
A1.4 结果判断
a）酶标检测仪测定OD值（空白对照调零），P/N＝2.1判为阳性（P：阳性抗原孔OD值；N：阴性抗原孔OD值）。
b）目测法：与对照孔比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色，阴性抗原孔基本无色。
A1.5 意义
IgM抗体阳性表示患者新近感染EHF病毒。本法具有高度敏感性和特异性，特别适用于EHF早期特异性诊断。
A2 应用间接酶免疫吸附试验（ELISA）检测EHF IgG抗体
A2.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化病毒抗原包被塑料板，与1∶100连续稀释的待检血清中的特异性抗体结合，其中血清IgG部分又与后加入的酶标记的抗人IgG结合，通过酶与底物的作用产生可见的颜色反应，根据反应产物的多少，即颜色深浅进行抗体的定量测定。
A2.2 材料
a）聚苯乙烯塑料板及可变微量加样器：同A1.2。
b）包被阳性抗原和正常对照抗原：细胞培养EHFV抗原（灭活）或初步纯化的基因工程表达抗原为阳性抗原；未接种EHFV的细胞培养正常抗原或无外源基因的相应表达系统的抗原为对照抗原。将阳性抗原和对照抗原作2倍稀释，包被聚苯乙烯塑料板，4℃过夜。以适当稀释的EHF恢复期血清测定抗原，选其中特异性抗原孔OD值最高，而对照抗原孔OD值低于0.05的抗原稀释度为工作浓度。
c）辣根过氧化物酶标记抗人IgG（HRP-IgG），按上述方法确定其工作浓度。
d）阳性对照血清（EHF病人恢复期血清）；待检病人血清（急性期和恢复期病人血清）。
e）抗原包被液，洗涤液，血清和结合物稀释液，底物液及终止液均同A1.2。
A2.3 检测步骤
A2.3.1 用0.1mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被聚苯乙烯塑料板，每孔100μL4℃过夜（或37℃2h），同时设阳性和阴性抗原各2孔，分别与阳性血清和待检血清反应。
A2.3.2 弃去包被液，用洗涤液重复洗3～5次，甩干。
A2.3.3 将待检血清从1∶100开始作4倍稀释，加入各抗原孔，每孔100μL37℃1h。
A2.3.4 弃去血清，洗涤液反复洗5次，甩干。
A2.3.5 加酶结合物，每孔100μL，37℃1.5h，同A2.3.4法洗6次，甩干。
A2.3.6 每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液，放室温暗处显色。
A2.3.7 当阳性抗原与阳性血清对照孔显黄色，而阴性抗原孔为无色（10～20min）后，每孔加入50μL2mol/L H2SO4终止反应。
A2.4 结果判断
a）目测法：即与阴性抗原孔相比较，阳性抗原孔明显呈淡黄，桔黄或深黄色显色反应，判为阳性。
b）酶标检测仪测定OD值（空白对照调零），P/N值大于2.1，判为阳性（P：阳性抗原孔OD/492值；N：阴性抗原孔OD/492值）。呈阳性反应血清最高稀释度的倒数，即为病人血清IgG抗体滴度。
A2.5 意义
恢复期病人血清比急性期血清IgG抗体滴度高，有4倍以上升高，可确诊感染，单份血清检测一般表明其曾受过出血热病毒感染，但抗体滴度大于等于1∶320时，结合临床表现及流行病学史，亦可确定为新近毒感染。
A3 应用反向被动血凝抑制试验（RPHI）检测EHF总抗体
A3.1 原理
先将绵羊红血球以戊二醛固定，使其表面阴离子化，再经鞣酸或氯化铬（交联剂）处理，使提纯的特异性抗体吸附到醛化红血球表面致敏，此致敏血球与相应的特异性抗原相遇，即发生特异性抗原抗体反应而使血球凝集，称为反向被动凝集（RPHA）。将含特异性抗体的待检血清与已知抗原先混合，使发生特异性抗原抗体反应而将抗原上的结合位点占据，此时加入抗体致敏血球就不能再与已知抗原起反应，因而不产生血凝，此法称为反向被动血凝抑制（RPHI）。反向被动血凝试验是用来检查抗原的，而反向被动血凝抑制试验则是用来检测抗体的。
A3.2 材料
a）微量塑料板：96孔，U型。
b）可调微量加样器。
c）高效价兔抗EHF IgG致敏的绵羊红细胞，每支含3％冻干红细胞1mL，使用前用蒸馏水恢复至1mL，再用稀释液稀释10倍成0.3％。
d）EHFV抗原（液体或冻干）：使用前必须测定血凝素效价并稀释成4个血凝单位使用。
e）稀释液：pH7.2，0.01mol/L PBS，含1％兔血清，用来稀释所有试剂和被检血清。
A3.3 检测步骤
A3.3.1 抗原血凝单位测定：采用96孔U型板，每孔加入25μL稀释液，取抗原25μL作1∶2，1∶4，1∶8，……，1∶256倍比稀释，然后加0.3％致敏红细胞液25μL于微型振荡器上混匀后，放37℃水浴1h，观察结果，以出现十十的抗原稀释度（如1：64）为1个血凝单位，其前2个抗原稀释度（1∶16）为4个血凝单位。
A3.3.2 被检血清稀释及反应：在U型微量反应板，每孔加稀释液25μL，待检血清先作1：10稀释，取25μL加入第一孔作倍比稀释，然后每孔加入4个血凝单位抗原25μL，混匀，放37℃水浴（湿盒）中作用30min，每孔再加入0.3％致敏的红细胞液25μl，同上混匀，再放37℃湿盒中2h，观察结果。
A3.3.3 设EHF病毒抗原（4个血凝单位）及稀释液空白对照，必要时设EHF病人阳性血清及阴性（正常人）血清对照。
A3.4 结果判断
在所有对照都成立的前提下，以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度的倒数为血清抑制抗体效价。
A3.5 意义
本法可作血清流行病学调查，疫苗免疫血清抗体检测。单份血清检测到反向被动血凝抑制抗体阳性，表明该个体曾受过EHF病毒感染，一般恢复期抗体水平比急性期有4倍以上抗体增高，方可确定诊断。
A4 用血凝抑制试验（HI）检测EHF血凝抑制抗体
A4.1 原理
许多病毒都有血凝抗原（血凝素），能选择性地与多种动物红细胞的受体作用，附着其表面，引起红细胞发生凝集反应，称为红细胞凝集现象，简称血凝（HA）。在血凝素中加入特异性抗体可抑制这种血凝反应，叫血凝抑制（HI），可用于血凝抑制抗体的测定。
EHF病毒的血凝要求条件比较严格，如对提供红细胞的动物种属（鹅或鸽）和反应的pH值等。不同型的病毒的血凝素及相应的血凝抑制抗体有差异，据此可对病人血清进行分型，推测病人由哪种型别病毒感染。
A4.2 材料
a）微量塑料板：96孔，U型。
b）可调微量加样器：20μL和100μL各一支。
c）血凝抗原（血凝素）：
野鼠型血凝抗原用汉滩型病毒制备，血凝滴度为≥1∶64；
家鼠型血凝抗原用汉城型病毒制备，血凝滴度为≥1∶32。
d）稀释液：
pH6.0磷酸盐缓冲液，用于制备新鲜鹅红细胞（60mL）；
pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液（含0.5％牛血清白蛋白），用于稀释血凝抗原和待检血清。
e）参考血清：
汉滩型免疫血清，汉城型免疫血清。
f）鹅红细胞制备：
鹅翅下静脉抽血，注入阿氏液中混匀，用生理盐水洗涤3次，最后1次以2000r/min离心10min，弃上清，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释鹅红细胞为0.3％，4℃冰箱保存备用。
g）待检血清的处理：
取待检血清用生理盐水配成1∶10，用10倍量4℃冷丙酮处理2次，离心弃上清（丙酮），将沉淀物真空或室温干燥；加入pH9.0硼酸－氢氧化钠溶液，恢复到1：10浓度，4℃冰箱过夜。于上述每管血清中加入0.05mL压积红细胞，混匀后37℃水浴吸附60min（中间摇动数次），离心取上清，即为1∶10处理血清。
A4.3 检测步骤
a）血凝抗原单位测定：
在96孔U型微量板上，每孔加入25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，取待测血凝抗原25μL加入第一孔，并从第一孔起作倍比稀释，最后一孔混匀后弃去25μL，然后于每孔补加25μL稀释液，加入50μL0.3％新鲜鹅红细胞，混匀后置37℃水浴60～90min，观察结果。以最高抗原稀释度出现十十为一个血凝单位（如1∶64）。检测抗体（分型）时用4个血凝单位（即1∶16）。
b）血凝抑制试验：
在U型微量板中，每孔加25μLpH9.0硼酸－氢氧化钠稀释液，再于第一和第二孔及第八孔分别加入25μL待检已处理血清，再从第二孔起作倍比稀释至第七孔止，第八孔不加抗原作血清非特异性凝集对照。除第八孔外，每孔加25μL4个单位血凝抗原，混匀。放37℃水浴反应1～2h，再于每孔加入50μL0.3％鹅红细胞，混匀后置37℃水浴箱中，反应1～2h，观察结果。
A4.4 结果判断
以完全抑制鹅红细胞凝集血清的最高稀释度倒数为血凝抑制抗体效价。
A4.5 意义
血凝素主要定位在包膜糖蛋白上，血凝抑制抗体出现部分反映病毒包膜糖蛋白的特性，血清型别的判定依据同份血清与两种血凝抗原的反应滴度不同来区分。如果单份血清与汉滩型血凝抗原反应滴度高于与汉城型血凝抗原反应滴定4倍或4倍以上，即判为野鼠型，反之亦然。
A5 用免疫荧光试验（IFAT）检测双份血清IgG抗体
A5.1 原理
荧光素（如常用的异硫氰酸荧光素，FITC）与抗体（IgG，IgM）经化学偶联后不影响荧光素显示荧光及抗体与抗原发生特异性免疫反应，当特异性荧光抗体（即结合物）与宿主细胞内相应抗原结合后，在荧光显微镜下显示荧光，表明有特异性抗原的存在。直接免疫荧光法可用于检查感染细胞内的特异性病毒抗原，间接法可检查待检血清中的特异性抗体。此法具高度敏感性和特异性，是目前应用最广的一种血清学方法。
A5.2 材料
a）多孔EHF病毒抗原片，用国内外标准病毒株感染Vero－E6细胞制备，-20℃以下干燥保存。
b）羊抗人或兔抗人IgG荧光素结合物。
c）待检病人血清（急性期和恢复期）。
d）荧光显微镜。
e）常用稀释液，试剂及设备（振荡器等）。
A5.3 检测步骤
A5.3.1 用pH7.4～7.6PBS稀释待检血清，从1∶20开始2倍或4倍连续稀释至需要稀释度。
A5.3.2 取出抗原片，用蒸馏水漂洗一次，冷风吹干。
A5.3.3 用加样器依次从高稀释度至低释稀度方向逐个加入已稀释的待检血清，所需量以完全覆盖细胞抗原面为准。在37℃水浴箱湿盒内孵育30～45min。
A5.3.4 用0.01mol/L pH7.4～7.6PBS振荡洗涤3次，每次5min，再用蒸馏水洗1次，脱盐，冷风吹干。
A5.3.5 按使用说明书要求，用PBS（含1∶3×104伊文思蓝）稀释荧光结合物，每孔加入量以完全覆盖细胞面为准，置37℃水浴箱湿盒内30min.然后同A5.3.4法洗涤、漂洗吹干。
A5.3.6 用荧光显微镜观察结果
A5.4 结果判断
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，根据荧光亮度，阳性细胞在细胞总数中所占的比例，可将免疫荧光反应大致区分为1～4个“＋”。无特异性荧光者为“－”。检测抗体滴度时，以发出明显特异性荧光反应（＋）最高血清稀释度的倒数来表示。
A5.5 意义
血清荧光抗体阳性，表明提供血清的个体曾受过EHF病毒感染，一般单份血清不能对现症病人作出确诊，回顾性诊断要求双份血清，即恢复期血清抗体滴度比急性期有4倍以上抗体滴度升高。本法多用于回顾性诊断及血清流行病学的调查。
