病原学诊断方法
A1 病毒分离
从病人呼吸道采集标本分离病原体。
A1.1 标本收集
风疹病人宜在出疹前4~5天至疹后1~2天取咽拭子标本。先天性风疹综合征患儿除咽拭子标本外,亦可于出生后尽快取尿液、眼泪、脑脊液、骨髓等标本。将灭菌棉棒稍蘸液体(2%牛血清Eagle液),反复涂抹患者咽部数次,然后将棉棒浸于上述标本液(1~1.5mL)中反复挤压,标本液中加足量抗生素(青、链霉素1000u/mL)及制霉菌素50μg/mL(或二性霉素5μg/mL)。
A1.2 接种
取0.1~0.2mL标本液接种于生长在试管中的单层原代乳兔肾细胞(PRK)(或其他原代细胞如原代人胚肾、兔胚纤维细胞、人胚二倍体细胞等)上,置37℃吸附1~2h后弃液,再加入含双倍常规抗生素量的维持液1mL,置33℃培养,每隔4天换液,连续观察8~14天。如无细胞病变可见,即置-30℃冻化3次,盲目传代。每次传代可接种于RK13、Vero、BHK21、LLC-MK2细胞上,连续盲传3代。
A1.3 观察细胞病变
一般于10天左右出现细胞病变。若不出现病变,可在接种14天后用100TCID50的ECHO11病毒或一定量的Sindbis、或VSV、或脊髓灰质炎病毒攻击,并设正常细胞种毒对照。若对照出现病变,接种标本管无病变,表示原接种的细胞内已有病毒感染的存在。
A 1.4毒株鉴定
用已知风疹病毒免疫血清,观察能否与新毒株起作用,传统用中和试验、血凝抑制试验或采用免疫荧光法作病毒鉴定等。
A2 病毒核酸检测
利用分子杂交技术或PCR技术检测风疹病毒核酸。