流脑血清学诊断方法
B1 玻片凝集试验
B1.1 目的
应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。
B1.2 材料
B1.2.1 待检的Nm菌株纯培养物。
B1.2.2 Nm诊断血清：多价I（包含A、B、C、D群），多价Ⅱ〔包含1889（Y）、1890（H）、1892（29E）］，多价Ⅲ［包含319（W135）、1916（X）、1486（I）、1811（K）群］及各群单价血清，共计14种。
B1.2.3 洁净载玻片。
B1.2.4 生理盐水。
B1.3 试验方法
B1.3.1 先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。
B1.3.2 用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。
B1.3.3 轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。
B1.3.4 检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。
B1.3.5 在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。
B2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
B2.1 目的应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。
B2.2 材料
B2.2.1 酶联免疫吸附试验检测仪。
B2.2.2 聚苯乙烯板（40孔或96孔）。
B2.2.3 加样器（单头或4头或8头，定量为0～200μL）。
B 2.2.4 羊抗人IgG辣根过氧化酶结合物。
B2.2.5 试验质控血清（抗体阳性和阴性的人血清）。
B2.2.6 菌体抗原（A、B和C群Nm标准菌株）或A群Nm多糖菌苗。
B2.2.7 包被液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液）：
碳酸氢钠（NaHCO3） 2.9g
碳酸钠（Na2CO3） 1.6g
叠氮钠（NaN3） 0.2g
加蒸馏水至1000mL，pH9.6，置4℃可备用两周。
B2.2.8 洗涤液（0.5mol/L氯化钠）：
氯化钠（NaCl） 29.3g
吐温－20（Tween－20） 0.5mL
加蒸馏水至1000mL，临用前配制。
B2.2.9 稀释液：
氯化钠（NaCl） 8.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.9g
氯化钾（KCl） 0.2g
吐温－20（Tween－20） 0.5mL
加蒸馏水至1000mL，pH7.4，置4℃备用。
B2.2.10 底物缓冲液：
（1）0.2mo1/L磷酸氢二钠
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 35.8g
蒸馏水 500mL
（2）0.1mol/L柠檬酸
柠檬酸[C3H4（OH）（COOH）3·H2O] 10.5g
蒸馏水 500mL
（1）液和（2）液分别置4℃备用。
临用前按下述配方配制底物溶液，pH为5.0：
（1）液 2.57mL
（2）液 2.43mL
邻苯二胺 4mg
蒸馏水 5mL
30％H2O2 15μL
B2.2.11 填充液：
稀释液 100mL
白明胶或牛血清白蛋白（Bovine Serium Albumin，BSA） 0.5g
B2.2.12 终止溶液：2mo1/L硫酸（H2SO4）。
B2.3 试验步骤
B2.3.1 包被抗原的制备
将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心（3000r/min，30min）洗涤菌体3次，再混悬于生理盐水中，置56℃30min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度，用包被液将其稀释成106个菌/mL作为包被抗原。对于A群Nm，亦可将A群Nm多糖菌苗稀释到10μg/mL进行包被。
B2.3.2 抗原的包被
用蒸馏水把酶标板各孔冲洗干净，空干水，置37℃烘干；往每孔中加包被抗原100μL，置4C过夜；倾出孔内液体，用洗涤液冲洗各孔3次，每次1min，并且均在干净的吸水纸上或纱布上拍打酶标板，空干孔内的液体。
B2.3.3 填充
空干孔中液体，用1mL吸管加填充液，每孔加以0.25mL；置室温30min，同上洗涤，空干孔内液体；酶标板置塑料袋中，密封贮存于4C，可备用一个月。
B2.3.4 检测待检血清
B2.3.4.1 病人急性期和恢复期血清均从此1∶2开始，用稀释液连续倍比稀释到第7孔，第8孔以稀释液代替血清作为阴性对照之一；酶标板置37℃培育1h后同上洗涤。
B2.3.4.2 加酶结合物
上述酶结合物用稀释液稀释到预试测定的最适工作浓度，每孔加100μL，置37C反应1h后同上洗涤酶标板。
B2.3.4.3 每孔加B2.2.10中配制的底物溶液100μL，置37℃反应15min。
B2.3.4.4 终止反应
每孔加2mol/L硫酸（H2SO4）50μL。
B2.3.4.5 测光密度值
在495nm波长下测定每孔的光密度值，并记录。
B2.3.4.6 每次实验设置下列对照：
阳性和阴性血清质控对照；抗原对照（以稀释液代替待检血清，其余同试验组）；缓冲液对照（以包被液和稀释液代替抗原和待检血清，其余同试验组）。
B2.3.4.7 结果判定
若被检孔的光密度值与平行对照孔的光密度值比值（P/N）≥2，即判断为阳性反应。
B3 杀菌力试验
B3.1 目的
应用微量杀菌力试验（TTC法）测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定。
B3.2 材料
B3.2.1 靶菌：对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的Nm（A群29019，B群和C群Nm）。
B3.2.2 稀释液：Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水
A液：氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，蒸馏水800mL；
B液：氯化钙（CaCl2）0.1g，蒸馏水100mL；
C液：氯化镁（MgCl2·6H2O）0.1g，蒸馏水100mL。
上述三液分别灭菌121℃，15min，置4℃备用。需用时按A液8份，B液和C液各1份的比例混合，pH为7.1。
使用时每100mL稀释液加灭活小兔血清1mL，万古霉素500μg，多粘菌素B2500单位或硫酸抗敌霉素5000单位。配就的稀释液盛于小瓶中，置4℃备用2周。
B3.2.3 滴定板：底部呈"U"形的96孔有机玻璃微滴板，并备用同样大小的普通玻璃作盖板。将它们平放在80℃的烤箱内烤2h后备用。试验完毕，以约80℃的热水泡板1h杀死靶菌，再以自来水冲洗干净，并用棉棒拭净不洁净的孔。最后以蒸馏水冲洗一次，37℃烤干后同上于80℃干烤。
滴定板使用一段时间后或遇到杂菌污染较严重时，可用热水杀死靶菌并冲洗干净；在比较稀的硫酸重铬酸钾清洁液内浸泡4h，冲洗干净后同上处理备用。
B3.2.4 兔补体
B3.2.4.1 补体可从幼龄兔或成龄兔血清中筛选，预试测定要求它们既不能具有自然杀靶菌的活性，但加有已知阳性参考血清时应产生较高杀菌抗体滴度。不过，幼龄兔被选中的机率较高。
B3.2.4.2 将所选家兔从颈动脉放血或抽取全部心血，置4℃，待血液凝固后尽早分离血清，混合后，分装到2mL安瓿中，每只放1mL血清。立即将安瓿置-20℃以下冰箱内冷冻过夜，次日进行冷冻干燥。冻干以后再抽样检查时，不应出现非特异杀菌反应，特异杀菌抗体滴度在1：3200以上则保存在-20℃以下冰箱内，可备用3～6个月。为减少补体批次间的差异，可将所选定的兔血清混合后进行冷冻干燥，再作质量检定，合格者则保存于-20℃以下。
B3.2.5 氯化三苯四氮唑（Triphenyl Tetrazolium Chloride，TTC）琼脂培养基（TTC琼脂）
B3.2.5.1 TTC琼脂配方：
牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，日本多胨3.0％，可溶性淀粉0.2％，以蒸馏水配制，调pH7.4～7.6，琼脂0.5％。
B3.2.5.2 TTC琼脂制作
上述培养基成分熔化后，按每10mL或20mL分装于大试管，121℃灭菌15min，冷却后置4℃备用。临用前将培养基加热熔化，每10mL培养基加50％葡萄糖注射液0.1mL，1％TTC水溶液（4℃避光保存）0.1mL，混匀放在45℃水溶液中待用。
B3.2.5.3 阳性参考血清
用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高（1∶3200以上）。
B3.2.5.4 滴管与滴头
采用临床上输液用的玻璃输液接头作滴管，滴头采用12号输液针，在砂轮上磨去针头的斜面部分，使其下口呈圆形。用滴管与滴头滴稀释液应是40滴/mL±2滴/mL。它们可用于滴加稀释液、补体、靶菌液、TTC琼脂及待检血清。如有条件，血清最好用25μL移液器稀释。
B3.3 杀菌抗体测定步骤
B3.3.1 靶菌液的制备
B3.3.1.1 开启A、B或C群Nm菌种，接种到巧克力色琼脂平皿上，37℃二氧化碳孵箱或烛缸培养15～20h，挑取3～5个菌落涂于另一平皿，同上培养10～15h。
B3.3.1.2 用Nm诊断血清和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查，以核实菌种。
B3.3.1.3 菌种被确证以后，取其菌苔，混匀于2mL灭菌脱脂牛奶管中，制成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL，置-20℃以下保存，Nm可存活3～6个月。
B3.3.1.4 需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放在4℃冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用2周。在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。
B3.3.1.5 从所分离的靶菌平皿上挑取3～5个典型菌落，涂抹转种1/4巧克力色琼脂平皿，37℃烛缸培养4～6h，刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀释液的试管壁上用白金耳将其充分研磨，制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。
B3.3.1.6 取出上述菌悬液2mL加到0.5cm的比色杯内，在波长为540nm的分光光度计上测其光密度值。
B3.3.1.7 稀释液用量按式（B1）计算：
X＝OD×10-0.1………（B1）
式中：X——稀释液用量，mL；
OD——光密度值。
按照式（B1）计算稀释液用量，然后往里加入0.1mL靶菌悬液，此时相当于光密度值为0.1的靶菌液作了10倍稀释。吹吸均匀后，由其开始再连续作10倍稀释至10－5稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含4000个菌落形成单位为宜。稀释时每个稀释度更换一个移液枪头。
B3.3.1.8 稀释好的靶菌悬液在1h内用完。若室温较高，可将菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。
B3.3.2 杀菌抗体的测定
B3.3.2.1 先在微滴板每孔内加1滴相当于25μL的稀释液。
B3.3.2.2 用移液器从每排第一孔内加25μL经56℃30min灭活的待检血清，吹吸5～10次后吸出25μL至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后一孔。每份血清分别用一支移液枪头。
B3.3.2.3 从低温冰箱内取出补体，于37℃温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。若补体已冷冻干燥，可往安瓿内加相当于补体血清原体积的稀释液，使其融化后即刻使用。
B3.3.2.4 每孔加一滴稀释成合适浓度的靶菌菌液，微滴板置微型振荡器上中速振荡5min，再在37℃培养25min，取出后重复上述振荡。
B3.3.2.5 每孔加2滴已熔化冷至45℃左右的TTC琼脂后，微滴板置37℃烛缸内培养15～20h后观察结果。
B3.3.2.6 每次试验需做下列对照：
阳性参考血清对照；4孔补体对照（稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性）；4孔细菌生长对照（稀释液、灭活补体和靶菌菌液各1滴）。每次检测时至少每5块微滴板中应有一组上述三种对照试验。
B3.3.2.7 往各孔滴完靶菌菌液之后，应将该菌液两滴分别滴加到一个巧克力色琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜下流，于37℃烛缸内同时培养，次日检查每滴靶菌的菌落数及其纯度。
B 3.3.2.8 判断结果时，先检查上述三种对照试验的结果：补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落；阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少于补体对照孔或不出现红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；如果所试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一半或更多时，则判断为杀菌阴性。
B3.3.2.9 根据红色点状菌落数目的多少，以符号“＋”记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生长时，应出现众多红色点状菌落，可记为“＋＋＋＋”。当所试各孔与其比较，菌落数减少30％以下，记为“＋＋＋”；减少50％左右记为“＋＋”；减少70％左右记为“＋”；每孔少于10个菌落则记为“±”。以细菌生长成呈“＋”及以下者判断为杀菌阳性；以“＋＋”及以上者判为杀菌阴性。以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。
