猩红热的实验诊断方法

　　A1 A组链球菌的分离

　　A1.1 标本采集：采取咽拭子、伤口炎性分泌物等标本。

　　A1.2 分离培养：可直接划线接种血琼脂平板进行分离培养。观察菌落形态及溶血现象，形成灰白色、透明或不透明、表面光滑、有乳光、直径0.5～0.75mm，圆形突起的小菌落，菌落周围形成2～4mm宽、界限分明、完全透明的溶血环。进一步涂片行革兰染色，证实为呈链状排列的革兰阳性球菌，菌呈圆形或卵圆形，直径0.5～1.0μm，链状排列，长短不一。分纯后进一步鉴定。

　　A2 A组链球菌的鉴定

　　A2.1 一般鉴定：可用以下试验加以鉴定。

　　A2.1.1 杆菌肽敏感试验：95％以上菌株对杆菌肽（每纸片含0.04单位）敏感，即抑菌环在10mm以上。方法是在血液琼脂平板上，用无菌棉棒将被检菌的肉汤培养物进行涂抹接种后，用无菌镊取杆菌肽纸片粘于平板上，于35～37℃培养18～24h观察结果。抑菌环大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。

　　A2.1.2 S×T敏感试验：S×T纸片含三甲氧苄氨嘧啶1.25mg和磺胺甲基异恶唑23.75mg.A群链球菌对S×T不敏感。操作方法同上。

　　A2.1.3 糖发酵试验：本菌发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和水杨素，产酸不产气，不发酵菊糖、阿拉伯糖和棉子糖。

　　A2.2 血清学分群法鉴定：

　　A2.2.1 沉淀法：先制备多糖体群抗原，提取方法较多，有Lancefield氏热盐酸提取法、甲酰胺提取法、高压提取法、酶提取法及亚硝酸提取法。以高压提取法最为简单，于30mL　Todd－Hewitt肉汤中，接种链球菌后，置35～37℃培养24h，3000r/min离心30min，弃去上清液。将沉淀物悬浮0.5mL的0.85％生理盐水中。于1.05kg/cm（上标始）2（上标终）高压蒸15min，离心沉淀，上清液即为C抗原，可保存于无菌试管或瓶中备用。操作时最好在内径小的试管中进行。先将抗血清加入小试管中，再沿管壁徐徐加入上述提取物（C抗原，可用盐水稀释1∶10、1∶20、……），15～20min后，两液接触面出现白色沉淀环为阳性，否则为阴性。

　　A2.2.2 葡萄球菌A蛋白（SPA）协同凝集分群法：先制备sPA稳定液，将金葡菌接种琼脂斜面，于35℃24h培养后用pH7.4 PBS 20mL洗下培养物，离心沉淀反复洗涤两次，加至原容量，再加甲醛溶液使最终浓度为0.5％，置室温3h，再放入80℃水浴30min，以PBS洗2次以上，配成10％溶液，加硫柳汞，使最终浓度为1∶10000.致敏时，将A群链球菌抗血清0.1mL加入1mL10％ SPA稳定液中，置室温30min，用PBS洗两次，再悬于10mL PBS中，加硫柳汞防腐。操作时，取培养4h的培养液10mL离心沉淀，弃去上清液。将沉淀细菌混悬于0.3mL pH8.0的Tris缓冲液中，加0.1mL（5mg/mL）胰酶溶液，置35℃培养1h，取1滴置载物玻片上，与致敏SPA悬液1滴混匀，轻轻摇动玻片，在2min内观察是否出现凝集，结果以＋～＋＋＋＋表示。＋＋以上为阳性。