病毒的分离与定型
A1 标本的采集、运送
粪便是分离脊髓灰质炎病毒的主要标本，由于脊髓灰质炎病人粪便排出病毒主要是在麻痹前期和麻痹后二周内，排毒呈间歇性，故标本的采集应在病人麻痹后14d内采集二份粪便，二次采集的间隔为24～48h，每份标本量5～8g。
由于病毒对热和对紫外线的不稳定性，因此采集的粪便应放在无菌的干净容器内，4℃以下冷藏保存和带冰运送，采集后应按规定贴好标签，一周内送到指定的实验室进行病毒分离。
A2 病毒的分离
A2.1 将粪便标本的半量（4g）放入含有小玻璃珠的50mL耐三氯甲烷塑料（带盖）离心管中，加含1/10三氯甲烷的pH7.0的磷酸缓冲液（或1/10三氯甲烷的Hank＇s液），拧紧盖后用力振荡10min，制成20％的粪便悬液。
A2.2 3000r/min，离心沉淀30min，无菌法吸出不含三氯甲烷的悬液层，一部分接种细胞，一部分保存于-30℃中备用。
A2.3 将标本悬液接种到生长良好并刚成片的Hep－2细胞和RD细胞管，每种细胞至少接种2管，每管加0.1mL悬液，并加0.9mL含2％牛血清的Eagle＇s液（pH7.2，内含青霉素100单位/mL，链霉素100μg/mL），另留二管正常细胞不加病毒只加1mL2％牛血清的Eagle＇s液作为正常对照。
A2.4 试管放36℃～37C倾斜5°静置培养。
A2.5 每天在显微镜下观察试管中的细胞病变，至少观察10～14d，当出现“＋＋＋～＋＋＋＋”时（即75％～100％病变时）将试管冻存于-20℃以下，备作病毒定型和型内鉴别应用。
A2.6 如第一代培养不出现细胞病变，则培养10d后将细胞冻化三次，取其悬液0.1mL再接种到同样的细胞管，进行盲目传代（接种和培养方法同第一代），逐日观察细胞病变，如阳性则冻存备用，如14d仍为阴性则作为病毒分离阴性。
A3 病毒的鉴定和定型
A3.1 准备4份组合的脊髓灰质炎病毒标准抗血清，各组的组合如下：
1）组合抗1，2，3型3个型的血清，每型血清在0.05mL内含20个单位的中和抗体；
2）组合抗1和2型血清，每型血清在0.05mL内含20个单位的中和抗体；
3）组合抗1和3型血清，每型血清在0.05mL内含20个单位的中和抗体；
4）组合抗2和3型血清，每型血清在0.05mL内含20个单位的中和抗体。
A3.2 4份组合血清，每份用1个吸头吸0.05mL加到96孔微量板的指定各个孔里，每组4孔，另4孔只加0.05mL维持液。
A3.3 用维持液将分离株的病毒分别稀释成10－3和10－4。
A3.4 加0.05mL10－3病毒液于已加混合抗血清的孔内4组，每组只加2孔，另2孔则各加10－4病毒悬液。
A3.5 病毒对照孔为0.05mL10－3（或10－4）病毒加0.05mL维持液，细胞对照孔为0.1mL维持液各加0.1mL细胞悬液。
A3.6 同时在E至H排分别做病毒分离株的滴定，每滴度加4孔，从10－8加起至10－3。
A3.7 充分振荡，混合后放37℃ 30min，于96孔板的每孔中各加0.1mL细胞悬液，含细胞104/0.1mL.A3.8加盖后再摇匀并放37℃二氧化碳孵箱培养，逐日观察每孔的细胞病变，至少观察7～10d。
