HDV感染的特异性检测
本标准要求用ELISA法检测HDV感染标记物，要求使用卫生部批准的诊断试剂盒。
A1 应用酶联免疫捕捉法检测抗HDIgM
A1.1 原理
根据抗原抗体间特异性结合的原理，利用抗人免疫球蛋白IgM（最好用抗μ链）捕捉待测血清中的IgM，然后加入HDAg，使之与血清中抗HDIgM结合，然后利用酶标记的抗HDIgG，既具有与HDAg相反应的特性，又具有酶的催化放大活性。当加入相应底物后，酶使底物氧化，使无色底物变为有色，利用颜色深浅或OD值的高低来确定抗HDIgM的有无及含量。
A1.2 材料
A1.2.1 聚苯乙烯塑料板：40孔或96孔。
A1.2.2 可变微量加样器：20μL和100μL各一支。
A1.2.3 抗人IgM（μ链）：鼠抗人IgM（μ链）单克隆抗体或兔（羊）抗人IgM（μ链）多克隆抗体。
A1.2.4 HDAg：用基因工程抗原粗提液。
A1.2.5 抗HDIgM阴性和阳性对照血清。
A1.2.6 HRP－抗HDIgG。
A1.2.7 包被液：0.5m01/L pH9.5～9.6的碳酸盐缓冲液（碳酸钠15.9g，碳酸氢钠29.3g）加水到1000mL，1∶10稀释使用。
A1.2.8 洗液：0.01mol/L，pH7.2～7.4，PBS T（内含0.85％氯化钠，0.05％Tween 20）。
A1.2.9 稀释液：0.01mol/L，pH7.2～7.4，PBS，用于稀释血清和标记抗体。
A1.2.10 底物液用前新配制。邻苯二胺（OPD）4mg，加基质液10mL（磷酸盐18.4g，柠檬酸钠5.1g溶于1000mL离子水中，pH5.0，4℃保存备用）。待用时溶化后加3％过氧化氢50μL混合均匀后立即使用。
A1.2.11 终止剂：2mol/LH2SO4。
A1.3 试验步骤
A1.3.1 用0.05mol/L pH9.5～9.6的磷酸盐缓冲液稀释抗人IgM（μ链）单克隆抗体，包被聚苯乙烯板，每孔100μL4℃过夜。
A1.3.2 用PBS T洗三次，拍干。
A1.3.3 每孔各加入100μL 1∶1000稀释后的待检血清和阴阳性对照血清（阴性对照3孔，阳性对照2孔），37℃，1h。
A1.3.4 负压下用PBS T洗板三次，抽干。
A1.3.5 每孔加入50～100μL经适当稀释后的HDAg2～4个ELISA单位，放45℃，1h。
A1.3.6 洗三次后，每孔加入50μL HRP-抗HDIgG抗体（于含10％小牛血清的PBS中），42～45℃，1h。
A1.3.7 洗三次后，加50μL新鲜配制的底物液，放室温暗处显色15～30min，当阳性对照显黄色后，每孔加入1滴（25μL）2mol/L硫酸终止反应。
A1.4 结果判断
A1.4.1 目测法：棕黄色，黄色为阳性；浅黄色可疑；无色阴性。
A1.4.2 比色法：测定492nm的OD值，并按式（A1）计算其S/N值，凡S/N大于2.1者为阳性；反之则为阴性。
A1.5 意义
抗HDIgM阳性表示急性期或近期HDV感染；HDV/HBV同时感染抗HDIgM多呈短暂阳性；如二者重叠感染则多呈持续阳性；如同时检测抗HBcIgM及抗HBcIgG亦可用之区别HDV/HBV同时感染或是重叠感染，故抗HDIgM检测具有重要诊断价值。
A2 酶联免疫吸附阻断法检测抗HD
抗HD总抗体其中主要是抗HDIgG。
A2.1 原理
利用抗原抗体之间的特异性反应，测定待检血清中的抗体阻断酶标记抗HD与HDAg之间特异性结合的能力。
A2.2 材料
A2.2.1 抗HDIgG多克隆或单克隆抗体用于包被。
A2.2.2 抗HDV阳性、阴性对照血清。
A2.2.3 HDAg，HRP－抗HDIgG，包被液，稀释液及洗液等均同上。
A2.3 试验步骤
A2.3.1 用包被液稀释抗HD抗体至适当浓度后包被聚苯乙烯板，每孔100μL，放37℃，1h，4℃过夜。
A2.3.2 负压下洗板二次抽干，每孔加入HDAg 50μL，放42℃，2h。
A2.3.3 洗三次后每孔分别加入1∶10稀释的待检血清50μL和阴性、阳性对照血清（设3孔阴性对照，2孔阳性对照），加入抗HD－HRP 37℃，1h。
A2.3.4 洗三次后，每孔加50μL新鲜配制的底物液放室温暗处显色15～30min，当阴性对照显色后每孔加1滴2mol/L硫酸终止反应。
A2.4 结果判断
目测法：无色或淡黄色为抗HD阳性；棕黄色或黄色为抗HD阴性。
比色法：测定待测样品及阴性对照孔的OD429，按式（A2）计算阻断率。
凡样品阻断率大于50％为阳性，反之为阴性。
A2.5 意义
抗HD阳性表明曾有过HDV感染，如高滴度亦可表示为现在感染。
A3 应用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测HDAg
A3.1 原理
HDAg外面被HBsAg包裹，用除污剂（Tween 20或NP40）裂解后才被释放出来。利用抗原抗体结合的免疫学原理，用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测HDAg。
A3.2 材料
A3.2.1 抗HDIgG纯化抗体，用于包被。
A3.2.2 抗HBc单克隆抗体，ELISA滴度1∶10万，用于稀释HRP抗HD。
A3.2.3 10％ Tween20。
A3.2.4 HRP－抗HD及其他材料同上。
A3.3试验步骤
A3.3.1 用包被液稀释抗HDIgG，包被聚苯乙烯板，每孔100μL，37℃，1h，4℃过夜。
A3.3.2 洗三次后，每孔分别加入待测血清及阴性阳性对照血清50μL（阴性对照血清3孔，阳性对照2孔）和10％Tween 2050μL，充分混匀后放室温过夜，使之裂解HDV表面包裹的HBsAg而释出HDAg。洗三次后，每孔加入50μLHRP－抗HD（稀释液中含10％小牛血清和10个ELISA单位的抗HBc单克隆抗体），放45℃，1h（或37℃，2h）。
A3.3.3 洗三次后每孔加50μL新鲜配制的底物液放室温暗处显色15～30min后，每孔加25μL2mol/L硫酸终止反应。
A3.4 结果
目测法：棕色或黄色为HDAg阳性；无色为阴性。
比色法：测定样品及阴性对照的OD492，按式（A3）计算S/N值，S/N值大于等于2.1为阳性。
A3.5 意义
HDAg可存在于受感染的肝细胞和血中，HDAg阳性示体内有HDV复制。
A3.6 注意事项
A3.6.1 HDV与HBV感染同时存在，血标本经除污剂处理后，HDAg与HBcAg仍可能同时存在，故要注意防止HBcAg的干扰，因而酶标记物中必须加入特异性中和HBcAg的单克隆抗体以排除之。
A3.6.2 因外周血中HDAg量少，故检测血清至少要用30～50μL。
A3.6.3 若阴性对照OD值为0，一般取0.05作为阴性对照值计算。
