病原学诊断方法

　　A1 病毒分离

　　从疑似流感病人呼吸道采集标本分离病原体。

　　A2 标本的收集和处理

　　A2.1 标本收集时间应于发病早期（1～3d内）越早越好。

　　A2.2 标本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集儿童标本，采集时将灭菌棉拭子稍沾标本收集液（pH7.2～7.6含20％～40％灭菌肉汤的生理盐水或Hanks液或生理盐水），反复擦拭患者咽部数次，然后将此棉拭子放进装有上述收集液的试管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集成人标本，采集时先让患者咳嗽，然后用10mL左右的收集液反复洗漱咽喉部约1min，吐入管内。如有条件，儿童标本用负压抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人标本用鼻咽洗液，可提高分离的阳性率。标本采集后置冰壶（4℃）中尽快送实验室。

　　A2.3 标本的处理：用毛细吸管反复吹打标本液（如为咽拭子标本，先反复挤压咽拭子后弃之），将粘液打散，于4℃静置5～10min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素1000单位和链霉素1000μg，混匀置4℃处理2～4h即可接种。如标本污染较重，可置4℃过夜处理。如预计标本在48h内不能完成接种时，应将标本置低温（最好-70℃）保存。

　　A3 接种及培养法

　　最常用鸡胚培养法和组织培养法，有条件的亦可同时用两种方法进行病毒分离。

　　A3.1 鸡胚培养法：取9～11日龄鸡胚，将处理过的标本液经羊膜腔和尿囊腔各接种0.2mL，每份标本接种3～4只胚，置33～35℃温箱培养3d，然后将鸡胚放置4℃冰箱过夜（或置-20℃冰箱1h再置4℃数小时）可分别收获尿液和羊水，并作初步血凝（其方法是用毛细吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑料板内，再加入1～2滴1％鸡红细胞，摇匀后置室温或4℃30～45min观察结果，根据血球凝集程度的不同可分为＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋、±、－），如血凝为＋＋＋～＋＋＋＋时，再按系列倍比稀释测定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鉴定。如血凝阴性，可盲传2代，如仍为阴性则弃之。

　　A3.2 组织培养法：用0.2mL处理过的标本液接种于长成单层的原代人胚肾（或猴肾或地鼠肾），或狗肾传代细胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份标本接种4管，置37℃吸附1～2h后弃标本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199维持液1mL，于33℃培养7～10d，并逐日观察病变。从第三天开始每隔一天用0.4％鸡或豚鼠红细胞对培养管做红细胞吸附试验（试验前无菌法收获细胞培养上清液），如阴性则用已收获的上清液盲目传代，如阳性则测定上清液的血凝滴度。如标本第1代红细胞吸附试验阴性，可用收获的全部上清液混合进行盲传2代，仍为阴性则弃之。

　　A4 新分离株的鉴定

　　新分离流感病毒可用血凝抑制、补体结合、中和以及血细胞吸附抑制等试验方法进行鉴定。最常用和最简单的方法是血凝抑制试验，必要时采用补体结合试验。

　　A4.1 血凝抑制试验：用当前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清与新分离流感病毒做血凝抑制试验，观察新分离株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制试验方法见附录B。

　　A4.2 红细胞吸附抑制试验：取红细胞吸附试验阳性的组织培养管和正常细胞对照管，用Hanks液洗细胞2次，加入经霍乱滤液（RDE）处理（1∶10）的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室温作用30min后，再加入0.4％鸡（或豚鼠）红细胞0.2mL，置室温30min后于普通光学显微镜下观察有无血球吸附。如果血细胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分离的病毒与所用免疫血清型别相一致或接近。

　　A4.3 补体结合试验：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清对新分离病毒的血凝均不能抑制，则应考虑可能为甲型流感病毒的新亚型，可用针对甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作补体结合试验定型。