血清学诊断（补充件）
B1 检测抗体
B1.1 间接荧光抗体试验（IFA）
一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。
B1.1.1 抗原片：收集经三恩氏（NNN）基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛体，离心沉淀（3000r/min）15min，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗涤3次后，用含0.2％福尔马林0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定，置冰箱内1h取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS洗涤一次，稀释至每个视野50～100个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置－20℃冰箱中备用。
B1.1.2 干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm直径的圆圈，在圈内滴入2滴（相当于20mm3）病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存待查。
B1.1.3 从滤纸上剪下干血滴，以0.2mL0.01mol/L pH7.2的PBS浸泡，相当于1∶20血清的稀释度（如被检样本为血清，则作1∶20稀释），置冰箱内过夜。试验时继续作倍比稀释至1∶320或1∶640，把不同稀释度的血清或干血滴浸泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37℃温育30min后，用pH7.2～8.0的PBS缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS浸泡10min，继续用蒸馏水洗一次，电扇吹干。
B1.1.4 分别滴加1∶10稀释的荧光标记的羊抗人IgG，置湿盒内于37℃温育30min，如前清洗，电扇吹干待检。
B1.1.5 检查时在玻片上加蒸馏水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用6×40倍的光学显微镜在高压汞灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。
B1.1.6 每次试验均以病人干血滴（或血清）和正常人干血滴（或血清）浸泡液及PBS作对照，由于正常人血样在1∶20稀释时亦偶可出现“＋”，故以“＋”为阳性标准，并以1∶20（即1∶20＋＋）为最低阳性稀释度。
B1.2 PVC薄膜快速ELISA
B1.2.1 抗原（前鞭毛体可溶性抗原）：收集利什曼原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3次，按压积体积加10倍量的0.01％硫柳汞生理盐水，在冰浴中超声处理2次，每次10min，反复冻融5次，经4000r/min离心3min，上清液存－20℃贮存备用。
B1.2.2 操作方法：
B1.2.2.1 实验前先在PVC致敏膜背面上编号，然后每孔加血清稀释液（PBS/T）0.2mL。
B1.2.2.2 按编号加入待测血清及参考血清（每批设一个阴性对照，一个阳性对照），每孔10μL，混匀置37℃ 5min（如放25℃室温，则需10min）。
B1.2.2.3 温育后，倾去稀释血清，用洗涤液（NaCl/T）连续洗8次，空干。
B1.2.2.4 加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL，放37℃内5min。
B1.2.2.5 倾去酶结合物，先用洗涤液洗8次，再用蒸馏水洗一次，空干。
B1.2.2.6 加入已加3％过氧化氢（H2O2）的四甲基联苯胺（TMBs）底物液，每孔0.2mL，反应5～10min，即可观察结果。
B1.2.3 反应标准：
目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性为鲜蓝色，阴性基本无色。
分光光度计比色判断：不用过氧化氢（H2O2）终止，选用595nm波长比色，以P/N≥ 2.1判为阳性（P-患者的光密度值；N-正常人的光密度值）。
B1.3 间接血凝法（IHA）
B1.3.1 取培养10～12天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量加4倍生理盐水，于冰浴中用150W，18kc，300mA功率超声处理10s，以pH6.4，0.075mol/L的PBS稀释20倍。Folin酚试法测蛋白量为200μg/mL。
B1.3.2 醛化：用健康人“Ｏ”型红细胞加10倍生理盐水离心4～5次。每8mL压积红细胞加1％戊二醛100mL，在4℃水浴中摇动30min，醛化红细胞再用生理盐水和蒸馏水或去离子水各洗5次，最后稀释成15％，另加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内保存。
B1.3.3 致敏：用pH7.2，0.75mol/L的PBS将醛化红细胞稀释为1.5％，离心洗3次，配成5％的细胞悬液加等量万分之一的鞣酸溶液，置37℃水浴中30min，每3～5min摇一次，用5倍量上述的PBS洗3次，再用pH6.4，0.075mol/L的PBS配成2.5％的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6.4的PBS稀释20倍的抗原，在37℃水浴中致敏45min，并加摇动，2000r/min离心3min后弃上清，加pH7.2的PBS重复离心一次，最后以含有1％正常兔血清的pH7.2的PBS配成1％备用。
B1.3.4 将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀并倍比稀释成2－1，2－2…2-12等浓度。取每一浓度血清0.025mL分别加入微量血凝板的12个6mm×7mm的"V"井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱布盒内，经室温1h后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清稀释度达2－7凝集者作阳性阈值，无凝集者为阴性反应。
B2 检测循环抗原
B2.1 单克隆抗体－抗原斑点试验（McAb－AST）
B2.1.1 待检血清递次作倍比稀释，分别取2μL滴于硝化纤维滤膜（0.45μm）上，室温放置30min。
B2.1.2 将滤膜浸入标准缓冲液（0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷）（Tris）－HCl pH7.4. 0.25％明胶，0.5％NP－40）内，室温2h。
B2.1.3 取出滤膜浸入McAb-C-2（1∶100稀释）内，4℃过夜。
B2.1.4 以缓冲液洗涤后与辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鼠IgG（1∶1000），于室温中孵育2h。
B2.1.5 洗涤后将滤膜置二氨基联苯胺底物液中，室温内反应30min，蒸馏水洗涤终止反应。
B2.1.6 滤膜干燥后目测以出现深棕色或棕色斑点，边缘清晰，直径较正常人血清反应为大者则判为阳性反应。未出现棕色斑点，与正常对照血清反应相近者为阴性反应。为更精确阅读结果，可待滤膜干燥后用岛津双波长TLC扫描仪（CS－910，S 460nm）测读光密度面积积分（Integral of surface area.ISA），阈值＞1.0以上者为阳性反应；阈值＜1.0为阴性反应。
B2.2 酶标记单克隆抗体斑点－ELISA直接法（McAb dot－ELISA）
B2.2.1 以戊二醛二步法标记提纯的单克隆抗体制备成HRP－McAb L12F7，－30℃保存备用。
B2.2.2 将待测血清依次作倍比稀释至1∶8.吸取2μL样本滴于硝酸纤维膜上，4℃阴干。
B2.2.3 滴有血清的硝酸纤维（NC）膜置于标准缓冲液（0.1mol/L Tris－HCl pH7.4 0.25％明胶，0.5％NP－40）内，室温摇床洗涤4次，每次10min。
B2.2.4 洗涤后加1∶100稀释的HRP－McAb，室温摇床2h，标准缓冲液洗涤6次，每次10min。
B2.2.5 加底物4－氯乙萘酚摇床10min，水洗中止反应。
B2.2.6 目测以出现蓝灰色斑点者为阳性反应。阴性则无蓝灰色斑点或仅有血清痕迹。
B2.2.7 每次试验均需设有阳性及阴性对照。
B2.3 单克隆抗体酶联免疫电转移印斑技术（McAb－EITB）
B2.3.1 血清样品处理：每份待检血清各取50μL，加pH7.4的PBS至1mL，3000r/min30min，取上清加0.2mL30％聚乙二醇（PEG分子量6000），4℃过夜，3000r/min30min，再以50％PEG洗涤，3000r/min30min，最后沉淀物加50μLPBs溶解备用。
B2.3.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）技术：实验使用10％分离胶（浓缩液3.3μL，3mol/L Tris－HCl 1.25mL，10％十二烷基硫酸钠（SDS）100μL，四甲基乙二胺（TEMED）5μL，10％过硫酸胺Ap50μL）。3％浓缩胶（浓缩液0.5mL，1mol/LTris－HCl 0.625mL，H2O23.8mL，10％SDS50μL，TEMED5μL，10％Ap25μL）。待胶板聚合完成后，每槽上样处理血清2μL.将制板插入电泳槽中，200V电泳50min。
B2.3.3 电泳转移：将胶膜覆盖在硝酸纤维膜上对正，排除气泡。开动电源，电流为200mA，电压为15V，电泳30min即可。
B2.3.4 转移后硝酸纤维膜用标准缓冲液（Tris－HCl pH7.4，明胶0.25％，0.5NP－40）洗三次，每次10min。
B2.3.5 加1∶500稀释的HRP－McAb L12H4，37℃1h后4℃过夜，标准缓冲液洗三次，DAB－H2O2系统显色10min，水洗中止反应。
B2.3.6 目测特异性条带，以130kD、100kD和25kD为阳性条带。
