血清学诊断方法
B1 血凝抑制试验方法
B1.1 原理
一些动物红细胞（如鸡、豚鼠等）以及人“Ｏ”型血红细胞上有流感病毒受体，遇流感病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒（血凝素）预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。
B1.2 主要材料
大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。
B1.3 双份血清收集及处理
急性期血清于发病3d内采取，恢复期血清于发病后2～4周采取。取0.1mL已分离的血清加入0.9（或0.4）mL霍乱滤液（RDE）（即1∶10或1∶5稀释）摇匀，于37℃水浴中过夜，以去除血清中的非特异性抑制素，次日置56℃水浴50min以灭活多余的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素制备
流感病毒接种鸡胚后48h收获的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。为了延迟尿盐沉淀可先用无菌生理盐水做等量稀释，置4℃备用。
B1.5 鸡红细胞悬液的制备
从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏（Alsevr＇s）液中，置4℃保存。用前以生理盐水洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用生理盐水配成1％浓度。
B1.6 血凝素滴定
将流感病毒血凝素在大孔塑料板内用生理盐水从1∶5开始做系列倍比稀释，每孔0.25mL再加入等量1％鸡红细胞，摇匀，置室温或4℃30～45min后观察结果，以出现十十血凝的血凝素最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。正式实验前经校对取4个血凝单位用于实验。
B1.7 血凝抑制试验步骤
B1.7.1 将上述已处理的待检血清（1∶10或1∶5）再用生理盐水做系列倍比稀释，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4个单位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1％鸡红细胞，摇匀置室温或4℃30～45min。
B1.8 结果观察
观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果。以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为抗体的效价。在检测患者双份血清时需在同一次试验中进行，并以恢复期血清抗体效价较急性期抗体效价升高4倍或4倍以上为阳性。
B2 型特异性补体结合试验
B2.1 原理
甲、乙、丙三个型流感病毒各具有特异的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亚型均具有相同的可溶性抗原，与乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用补体结合试验来区别它们。当流感病毒出现很大的变异或出现新亚型而引起大流行时，由于来不及充分掌握新分离毒株的性状，常需同时采用补体结合试验和血凝抑制试验对新毒株进行血清学诊断。
B2.2 型特异免疫血清制备
B2.2.1 免疫用抗原
甲型为PR8株和乙型为Lee株均为小鼠适应株。于乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染后3～5d大部分小鼠发病、部分死亡时，解剖小鼠。取肺研磨并用生理盐水制成10％的悬液，低速离心去除粗块，取上清鼠肺悬液即为免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清制备
选体重300～500g的健康豚鼠，免前采血3～5mL，分离血清分装冻存留作对照。豚鼠用乙醚轻度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺悬液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次间隔一周，在末次免疫的同时，由腹腔注射鼠肺悬液2mL，一周后试血，如果对同型尿膜抗原的血清效价超过1∶80，而与异型抗原无交叉反应，立即采血分离血清分装冻存于低温（-20℃以下）。试验前血清于56℃水浴灭活30min。
B2.3 可溶性抗原的制备
用甲、乙型流感病毒或新分离病毒按常规接种和收获尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上时，收获其尿囊膜，将尿囊膜用盐水洗一次，用无菌剪刀将膜剪成数小块放入试管中，每个鸡胚的尿囊膜加1mL无菌生理盐水，冻化三次，末次化后以3000r/min离心15min，吸出上清即为可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一个月。
B2.4 双份血清采集
收集病人急性期（发病3d内）和恢复期（发病10～30d后）的血清。血清于试验前56℃30min灭活。
B2.5 1％绵羊红细胞悬液制备、溶血素、补体的制备和滴定按常规方法。
B2.6 补体结合试验步骤
按常规进行。
B2.7 结果判定
B2.7.1 被检病毒尿膜抗原与甲型（或乙型）流感病毒免疫血清呈阳性反应则可诊断为甲型（或乙型）流感病毒，如甲、乙均为阴性时，应考虑丙型流感病毒或其他病毒。
B2.7.2 双份血清对甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可诊断为甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群补体结合抗体滴度一般在1∶16以下，如单份恢复期血清抗体在1∶32以上时，结合临床症状可作诊断的参考。
B2.7.4 人群血清抗体水平调查中，补体结合抗体在1∶32以上者可作为新近感染流感的证据。
B3 神经氨酸酶抑制试验
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物经流感病毒的神经氨酸酶作用后，使N乙酰神经氨酸游离出来，经过碘酸盐的氧化作用将N乙酰神经氨酸转化为β－甲醛内酮酸，后者经硫代巴比妥酸作用形成生色团，用有机溶剂提取生色团，并在分光光度计上比色。利用上述反应可测知流感病毒的神经氨酸酶活性，反应的颜色越深酶活性越强。并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。神经氨酸酶抑制试验是将标化好剂量的神经氨酸酶（即一定稀释度的流感病毒尿囊液）和系列稀释的被检血清和正常血清起孵育，测知血清作用于神经氨酸酶活性的抑制效价，并计算出血清的神经氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及试剂
B3.2.1 小试管、10mL吸管及分光光度计等。
B3.2.2 磷酸缓冲液（PBS pH5.9）及生理盐水。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰冻干燥的胎球蛋白加蒸馏水10mL，溶解后置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 过碘酸钠溶液：称4.8g过碘酸钠（NaIO4溶于38mL蒸馏水中，加62mL正磷酸（浓），充分混合，置于棕色磨口瓶中，室温保存。
B3.2.5 砷试剂：称10g砷酸钠（NaAsO2）和7.1g无水硫酸钠溶于100mL蒸馏水中，加0.3mL浓硫酸，置于带玻璃塞的瓶中，置4℃保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸试剂：称1.2g硫代巴比妥酸和14.2g无水硫酸钠加入200mL蒸馏水中，在煮沸的水浴中加热溶解，每周新配。
B3.2.7 酸化丁醇试剂：于100mL正丁醇中加入5mL浓盐酸，置棕色带玻璃塞的瓶中，室温保存。
B3.3 神经氨酸酶活性测定
B3.3.1 病毒用生理盐水做系列倍比稀释（1∶2～1∶32）分装小试管，每管0.1mL.标准病毒和未知病毒的神经氨酸酶应在同一试验中测定。
B3.3.2 每管补充加入0.1mL生理盐水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配制的胎球蛋白底物，对照管用盐水代替病毒，充分混合后置37℃水浴作用18h.
B3.3.3 从水浴中取出试管在室温冷却，每管加入0.1mL的过碘酸盐试剂，充分混合，室温静置20min（时间要准）。
B3.3.4 每管加入1mL砷试剂，由于碘的释放出现棕色，摇动试管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥试剂，并充分混合（该试剂需在煮沸溶解后加入），用棉塞将管口堵紧。
B3.3.6 立刻将试管置于煮沸的水浴中，煮沸10min，可见红色出现，即为神经氨酸酶活性的表现，颜色越深酶活性越高。
B3.3.7 将试管置冰水中冷却后去掉棉塞，加入4mL丁醇试剂，换上干净橡皮塞，用手剧烈摇动试管，提取颜色使其转到有机物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min离心5～10min使丁醇层清亮透明，小心地吸出上层的丁醇，放入干净的试管中待检。
B3.3.9 将上述受检样品由高稀释度到低稀释度依次倾入透光池中，其中第一个透光池加入无病毒的对照管液，将分光光度计波长调至549nm，将对照管调至零，然后依次读取每个稀释度样品的光密度。
B3.3.10 酶单位的计算：酶活性测定时光密度为0.45～0.85的病毒稀释度作为一个酶单位。
B3.4 神经氨酸酶抑制试验
B3.4.1 按上述方法测定酶活性，选用1个酶单位的病毒稀释度（即酶活性测定时光密度为0.45～0.85的病毒稀释度），每管加入0.1mL.
B3.4.2 受检血清做系列倍比稀释，每管病毒加入不同稀释度血清0.1mL，血清对照管是以最低稀释度血清加生理盐水代替病毒，37℃水浴作用1h.以同法做正常血清对照组。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配制的胎球蛋白0.1mL，充分摇匀，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出试管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各种试剂。
B3.4.5 测定光密度时应从低稀释度血清管至高稀释度血清管，检测方法同B3.3.9。
B3.5 神经氨酸酶抑制抗体滴度的计算法
B3.5.1 根据抗血清和正常血清两组试验的实验结果，求得每组血清同一稀释度的光密度之商数，即为经血清作用后所余之酶活性的百分数。血清稀释度越高，残留的酶活性也越高，找出50％酶活性前后两个血清稀释度及其相应的酶活性百分数，按公式计算出血清神经氨酸酶抑制抗体滴度。
