01群霍乱弧菌的鉴定和分型（参考件）
C1 血清分型
用普通琼脂或碱性琼脂培养基上的菌苔进行血清分型。分型使用小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应。
C1.1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。
C1.2 在小川型单价血清不凝集，在稻叶型单价血清凝集者为稻叶型。
C1.3 在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。
C2 试管凝集试验
用生理盐水自1∶20开始对倍连续稀释01群霍乱多价血清，每管含稀释血清0.5mL.将被检菌在营养琼脂的16～18h培养物用0.2％福尔马林生理盐水制成每毫升约含18亿菌体（相当于细菌标准比浊管浓度）的悬液，每稀释血清管加入0.5mL；另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作对照。摇匀，置37℃3h观察初步结果。再放4℃或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使试验菌出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度，凝集滴度达到或超过血清原效价一半的即可确定为01群霍乱弧菌。
对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应做本试验。
C3 古典型和埃尔托型的鉴别
C3.1 按表C1所列的试验鉴别01群霍乱弧菌的两个生物型。
C3.2 试验方法：
a. 第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验：
本项试验与噬菌体分型在同一平皿上进行，方法见C4.1.2。
b. 多粘菌素B敏感试验：将1.5％普通琼脂加热溶化，待冷却至50℃左右，按每毫升培养基加入50单位多粘菌素B，摇匀后倾注平皿，凝固后备用。在平皿背面用玻璃笔划出若干方格。将被检菌2～3h肉汤培养物一接种环点在培养基表面，待干后放37℃培养过夜，观察结果。被检菌不生长或生长不足10个菌落为敏感，记录为＋号。
c. 鸡血球凝集试验：在清洁平皿内划出方格，用直径4mm的接种环取一滴生理盐水滴在每个方格内，取被检菌18h琼脂培养物少许，在生理盐水中制成浓厚菌悬液。再用接种环各加一滴经洗涤三次的2.5％鸡血球生理盐水悬液，充分摇匀，肉眼观察结果。1min内出现血球凝集者为阳性，血球呈均匀分散状态者为阴性。埃尔托型为阳性，古典型一般为阴性。
d. V－P试验：将被检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水，37℃培养2～3天。然后取出1mL培养物加5％α－萘酚乙醇溶液0.6mL，振荡5s，加入40％氢氧化钾液0.2mL，再振荡5s，去掉棉塞置室温。在1h内出现红色反应者为阳性。阴性者在试剂加入后逐渐出现浅褐色。古典型为阴性，而埃尔托型多为阳性。
e. 溶血试验：取被检菌24h普通肉汤（中试管装8～10mL）培养物1mL，1％绵羊红血球（生理盐水洗3次，最后1次离心速度为2000r/min，离心10min）1mL，混匀后放37℃，2h观察初步结果，再放4℃冰箱过夜观察最后结果。试验应有已知溶血株、不溶血株和肉汤管做对照。达半数血球溶解者为溶血阳性。为证明为不耐热溶血素，可将被检菌的培养物加热56℃ 30min后再做溶血试验。古典型不产生可溶性溶血素，埃尔托型有些产生，有些不产生不耐热的可溶性溶血素。
C4 噬菌体－生物分型
C4.1 噬菌体分型
C4.1.1 利用五株国内分离的弧菌噬菌体（VP1～VP5）将埃尔托型霍乱弧菌分成32个噬菌体型。
C4.1.2 噬菌体分型方法：在1.5％普通琼脂平皿的背面，用玻璃笔划出9个方格，再将被检菌2～3h肉汤培养物0.2mL加至已融化并冷至50℃的0.7％4mL半固体琼脂中，混匀后倾注于琼脂平皿上。待干后，于第1～5格分别滴加VP1～VP5分型噬菌体的原液（108～109/mL）第6、7格分别滴加第Ⅳ组霍乱噬菌体原液（109/mL）及常规稀释液（106/mL）；第8、9格滴埃尔托型霍乱弧菌的溶原噬菌体两个代表株（溶原性菌株的18～20h肉汤培养物，经56℃30min水浴杀菌后使用），作为对溶原噬菌体敏感性的测定。待干后放37℃培养过夜，观察结果。依据被检菌对VP1～VP5噬菌体的敏感性，按表C2判定其噬菌体型别。
C4.2 埃尔托型霍乱弧菌的生物分型
C4.2.1 根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托型霍乱弧菌分成12个生物型。
C4.2.2 溶原性测定：从埃尔托型霍乱弧菌复愈型抗链霉素株SM6的普通琼脂平皿培养物上挑取光滑圆整的典型菌落接种普通肉汤，37℃培养8～12h，作为指示菌。
在直径9cm平皿中倾注一薄层1.5％普通琼脂培养基，待凝固后，于平皿底的背面用玻璃笔划出16～20个方格，并注明被检菌号。
将4mL0.7％普通半固体琼脂培养基加热融化，待冷至50℃加入链霉素2000单位及指示菌0.3mL，混匀，倾注于上述已凝固的琼脂平皿底层上。待凝结后，将被检菌的18～24h肉汤培养物，用接种环分别滴加在指示菌平皿的每个小格内，待干后放37℃培养过夜。出现不透明的磨玻璃样噬斑或裂解区，边缘有明显的、窄的、不圆整的裂解环者为阳性。
C4.2.3 对溶原噬菌体敏感性的测定：在噬菌体分型的平皿上，滴加埃尔托溶原噬菌体代表株（溶原性菌株的18～20h肉汤培养物，经56℃ 30min水浴杀菌后使用）37℃培养过夜后观察结果。出现不透明噬斑者为阳性，表明被检菌株对溶原噬菌体敏感，即为复愈型菌株，不出现噬斑者可能是溶原株，也可能是非溶原株。
C4.2.4 山梨醇发酵试验：将0.1g蛋白胨与0.5g氯化钠加于100mL蒸馏水中加热溶解。调整pH8.0或9.0之后，加0.25％酚红指示剂1mL和山梨醇2.0g，溶解后分装小试管，每管3mL，0.06MPa高压蒸汽灭菌20min.取被检菌2～3h肉汤培养物0.1mL，接种于山梨醇发酵管（pH8.0），37℃培养3h观察结果。流行株发酵迟，培养基呈粉红色，为（－）；非流行株发酵快，培养基呈黄色，为（＋）。使用pH9.0山梨醇发酵管时，培养4～5h观察结果。
C4.2.5 溶血试验：同C3.2e。
C4.3 噬菌体生物分型区分两类菌株标准
将噬菌体分型与生物分型结合起来，即噬菌体－生物分型，可将埃尔托型霍乱弧菌区分为流行株和非流行株两类菌株。噬菌体1～5型－生物型a～f为流行株，其中噬菌体1～3型－生物型a～d为常见的流行株，如1a、1d、3b等。噬菌体6～32型－生物型g～1为常见的非流行株，如8i、9k、30k等；噬菌体1～5型－生物型g～1和噬菌体6～32型生物型a～f均为不常见的非流行株。
在埃尔托霍乱疫情处理时按噬菌体－生物分型结果区别对待，对流行株所致霍乱要加强监测和控制，对非流行株所引起的腹泻病例按一般腹泻病菌处理。
