间接血凝试验和反向血凝试验的操作步骤及判定

　　C1 间接血凝试验（PHA）

　　C1.1 疑似鼠疫病人在急性期间及恢复期间，以及具有可疑鼠疫病史的人应取其静脉血进行间接血球凝集试验，以检查血液中是否具有抗鼠疫菌F1抗体。

　　C1.2 被检材料

　　C1.2.1 各型鼠疫患者均应采取静脉血3～5mL，分离血清。

　　C1.2.2 被检血清均应56℃30 min灭活供诊断用。

　　C1.3 试剂

　　C1.3.1 2.5％F1抗原致敏血球。

　　a）用细菌凝集效价为1∶320的鼠疫全菌免疫血清，血凝滴度应不低于1∶40000。

　　b）与假结核血清交叉滴度应不高于1∶5。

　　符合a）、b）的致敏血球为合格的诊断用血球，每一鼠疫季节开始前或更换致敏血球批号时应进行上述滴定。

　　C1.3.2 1％正常兔血清盐水。

　　C1.3.3 2.5％单宁酸血球。

　　C1.3.4 F1抗原液（50～100μg/mL）。

　　C1.4 操作步骤

　　C1.4.1 取小试管（15mm×100mm）两列，第一列第一管加入1％正常兔血清盐水0.9mL，其余各管各加0.5mL，为血凝抑制列，第二列的各管加入0.25mL，为血球凝集列。

　　C1.4.2 取被检血清0.1mL加入第一列的第一管，进行双排并列倍比稀释如表C1所示，第一管混匀后，吸取0.75mL，其中0.25mL加入第二列第一管内，0.5mL加入第一列的第二管中，混匀后，再吸取0.75mL，依次如前稀释，直至最后一管，弃0.5mL。

　　表C1 试管法血凝、血凝抑制试验操作（二排试验）

　　C1.4.3 第一列每管内各加入0.25mLF1抗原液（50～100μg/mL），混匀后置37℃温箱10～15min。

　　C1.4.4 于各管内加入2.5％F1抗原致敏血球一滴（0.05mL），混匀后置37℃温箱，2h后观察结果。

　　C1.4.5 试验同时设下列对照管：

　　a）1％正常兔血清盐水0.5mL＋2.5％F1抗原致敏血球0.05mL；

　　b）1％正常兔血清盐水0.5mL＋2.5％单宁酸血球0.05mL；

　　c）1∶20被检血清0.5mL＋2.5％单宁酸血球0.05mL。

　　C1.5 结果判定

　　C1.5.1 各对照管不应呈现凝集。

　　C1.5.2 第二列为试验列，根据血球凝集程度分为下列几种：

　　a）“＃”凝集血球铺满管底，有明显折边，抗体过量时，凝集呈疏松花圈状；

　　b）“＋＋＋”凝集血球铺满管底，无折边；

　　c）“＋＋”血球不完全凝集，管底呈整齐的圆圈，但圈内外有非常明显的血球凝集；

　　d）“＋”管底形成较小的圆圈，在圈内外只有很少的血球凝集。