白喉病原学诊断方法

　　A1 白喉杆菌的分离培养和鉴定

　　从病人咽部假膜或鼻咽部采集标本分离病原体。

　　A2 标本的采集

　　A2.1 病人

　　以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附新鲜配制的亚碲酸钾、甘油盐水保存液从疑似患者咽喉假膜边缘蘸取标本或同时采取鼻咽拭子，放入灭菌试管内同时送检。

　　A2.2 带菌者或疑似病人

　　由于未见到明显的假膜，故应采集鼻咽部或扁桃体粘膜上的分泌物送检。

　　A3 鼻咽拭子接种吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基等作细菌培养观察鉴定

　　A3.1 菌型

　　革兰氏阳性细长杆菌呈棒状，排列不规则，常呈人字形、栅栏状。庞氏染色可见异染颗粒。

　　A3.2 培养及生化特性

　　白喉杆菌在血平板上形成灰白色、圆形光滑菌落，有溶血环。在亚碲酸钾血平板上，菌落呈中心黑色或灰黑色，边缘带灰色。在尿素卵黄双糖培养基上，经37℃12～48h培养后可做初步鉴定。白喉杆菌发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖，产酸不产气，不发酵乳糖、甘露醇，一般不分解蔗糖。不产生吲哚，能还原硝酸盐，酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不分解尿素。重型白喉杆菌能分解淀粉、糖原和糊精，迟缓分解蔗糖。依据形态、培养、生化特性可将白喉杆菌分为轻、中、重三型。

　　A4 毒力试验

　　白喉是由白喉杆菌引起的急性传染病，其致病因素为外毒素。抗原性强，毒性剧烈。白喉杆菌不是所有菌株都有毒力，只有那些携带β－棒状杆菌噬菌体的菌株才能产生外毒素。毒力试验可测定白喉杆菌产生外毒素的能力，常用的方法有两种。

　　A4.1 艾立克（Elek）氏平板毒力试验

　　将Elek培养基加热熔化，冷却至50℃左右，加入正常无菌（兔或牛）血清2mL，混匀后用无菌镊子取预先制好的白喉抗毒素（每毫升含5000～10000u），干燥滤纸条贴于平板中央表面，置37C孵箱内约0.5h，烘干表面水分，时间不宜过长，以免影响结果。

　　将试验菌株划线接种于平板上成一直线，使其与抗毒素滤纸成直角相交。同一平板可同时接种4～5个标本。同时要用已知有毒菌株作阳性对照。于37℃培养48～72h，如发育良好即可观察结果。阳性者于距纸条稍远处沿接种线开始有絮状沉淀弧出现。若干72h仍未出现沉淀弧者可作阴性报告。

　　A4.2 豚鼠皮内接种毒力试验

　　将待试菌株接种吕氏血清斜面，于37℃培养16～18h，加肉汤1mL，刮下菌苔，使成悬液，吸取此菌液0.5mL，加入3.5mL肉汤中，混匀后即可应用。同时要用已知有毒菌株作对照。

　　选体重250g左右豚鼠两只，一只在试验前24h腹腔注射白喉抗毒素1000u，作为对照动物；另一只不注射抗毒素，作为试验动物。接种前先将动物腹部向上，固定在架上。以温水洗净腹部后剃毛。剃毛后再用无菌生理盐水擦洗一次待干，用1mL注射器吸取菌液，准确注射0.1mL于皮内，可同时接种6～8株菌。注射后4h，给试验动物注射抗毒素4000u，以免因毒株毒力太强而致死。

　　注射后经24、48、72h，各观察皮内反应一次。对照动物无论接种有毒或无毒菌株，均应无局部反应；试验动物在注射有毒株的部位，于24h呈红肿，48h在红肿部位边缘有化脓性病变，72h可见硬块，出现灰黑色坏死斑，无毒的菌株则无病变。动物毒力试验也可应用家兔及小鸡作试验动物。