免疫学诊断方法
A1 间接红细胞凝集试验(IHA)
A1.1 抗原制备
用2.5%戊二醛醛化的绵羊红细胞,经终浓度1∶20000鞣酸处理后,以最适浓度的囊液粗抗原或纯化的抗原致敏。致敏后的红细胞以含10%蔗糖及1%正常兔血清的pH7.2PBS配成5%悬液分装安瓿(1mL/支),置4℃冰箱保存或冻干封存(0.2mL/支)。使用浓度为1%。
A1.2 操作方法
A1.2.1 准备抗原:如为冻干产品,则加入1mL蒸馏水稀释混匀备用。
A1.2.2 用微量滴管滴加1%兔血清-磷酸缓冲盐水于V型微量反应板上第一孔加3滴,其余各孔均为1滴(25μL);至少做六孔。第一孔加待检血清1滴(25μL)即血清稀释度为1∶4;混匀后从中吸取血清1滴加入第二孔;混匀,依次作倍比稀释;最后一孔混匀后吸弃1滴。并平行做阴性、阳性对照。
A1.2.3 从第二孔起,每孔加入致敏红细胞悬液1滴(25μL);立即振摇1min;加盖板,室温下静置1h,观察结果。
A1.3 结果判断
A1.3.1 阴性反应:红细胞全部沉入孔底呈点状,边缘光滑。
A1.3.2 阳性反应:以血清1∶128稀释出现阳性反应者(++或+++)判为包虫血清抗体阳性。
+++ 红细胞形成薄层凝集,充满整个孔底或边缘有皱褶。
++ 红细胞形成薄层凝集,面积较小,边缘松散。
+ 红细胞大部分沉于孔底,形成一圆点或圆圈,周边模糊或中心有白色小点。
A2 酶联免疫吸附试验(ELISA)
A2.1 抗原
包虫囊液纯化抗原(磷钨酸、氯化镁沉淀法制备)。
A2.2 操作方法
A2.2.1 抗原包被聚苯乙烯板:用0.05mo1/LpH9.6碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度,每凹孔加入100μL,置温盒。4℃过夜(或12~24h),次日,倾去抗原,用含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水(0.01mol/L,pH7.4 PBS-T)洗涤3次,每次5min,甩干。
A2.2.2 加待检血清:血清用PBST作1∶200稀释,每凹孔加入100μL,每板应设参考阳性一孔,参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒,37℃1h,然后取出,倾去血清,洗涤同前。
A2.2.3 加结合物:加入用PBS-T作工作稀释度的辣根过氧化物酶(HRP)-标记结合物100μL,37℃,1h倾去结合物,洗涤同前。
A2.2.4 加底物:通常加邻苯二胺(OPD)底物溶液(10mg OPD+25mL pH5.0柠檬酸缓冲液+30%H2O2 10μL)100μL,37℃,30min。
A2.2.5 加中止液:2mol/L H2SO450μL。
A2.3 结果判断
在酶标专用比色计上读取492nm OD值,以待测样本(S)对阴性对照血清(N)的S/N值≥2.1为阳性临界值。
A3 PVC薄膜快速ELISA
A3.1 抗原
包虫囊液纯化抗原。
A3.2 操作方法
A3.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜软板,编号,用PBS-T洗一次,然后每孔加PBS-T200μL;
A3.2.2 加待检血清及参考血清(每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔)每凹孔10μL,混匀,置湿盒37℃ 5min(或25℃室温10min)。倾去血清,用PBS-T连续洗8次,甩干。
A3.2.3 加酶结合物:按工作浓度稀释,每孔200μL,37℃ 5min,倾去结合物,同上洗涤8次,再加蒸馏水洗一次,甩干。
A3.2.4 加入底物溶液:含3%H2O2的TMB底物,每凹孔200μL,反应5~10min(TMB底物溶液的制备:TMB50mg溶于10mL二甲基亚砜中作为母液,4℃保存。用前取母液1mL+pH5.0柠檬酸缓冲液50mL+30%H2O28μL)。
A3.3 结果判断
按每批的阴性及阳性对照目视判断结果。阴性基本无色,阳性为鲜蓝色。
A4 酶联免疫印渍技术(EITB)
A4.1 抗原膜条制备
采用5%~20%厚0.75mm梯度胶,包虫囊液抗原按1μg/mm加入,上槽缓冲液为0.1mol/L硼酸缓冲液,下槽液为0.424mol/LpH9.18Tris/HCl,抗原经SDS-PAGE电泳分离后,再经转移电泳。转移电泳液为0.212mol/L pH9.18Tris/HCL,含20%甲醇电泳30min,即将分离的抗原蛋白带由凝胶转移到硝酸纤维膜上,此膜用PBS-T洗3次,PBS洗1次,每次5min,然后将膜切成3mm宽的长条,此为抗原膜条,夹于PBS湿滤纸中封于塑料袋,保存于冰箱中备用,若存于低温冰箱,可长期保存。
A4.2 操作方法
A4.2.1 试验时,将膜取出或解冻。先于反应槽中加入495μL含5%脱脂奶粉及3%吐温PBS,再加入5μL待检血清,最后加入抗原膜条,每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇1h(4℃可过夜)。次日,用0.3%吐温-PBS洗4次,每次5min吸干。
A4.2.2 加入工作浓度稀释的结合物,室温1h,洗涤同前。
A4.2.3 加入DAB-H2O2系统(25mg3,3′-二氨基联苯胺+50mL无吐温PBS+5μL H2O2)显色10min,自来水冲洗中止反应,晾干。
A4.2.4 判读结果:目测特异性条带,以60KD、36KD、32KD、24KD、20KD、17KD和12KD为阳性条带。其中只要出现12KD、17KD、24KD条带即可判为阳性。
A5 循环抗原检测
A5.1 将抗包虫单克隆抗体用0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板,每孔100μL,4℃过夜后用PBS-T洗板3次。
A5.2 每孔加入含10%小牛血清的PBS-T 100μL,于37℃下封板1h,洗板3次。
A5.3 待检血清用上液稀释为1∶2,每孔加100μL,每份标本加两孔,37C温育1h,洗板3次。
A5.4 加入工作浓度的HRP标记单抗100μL 37℃ 1h后,洗板3次。
A5.5 加入OPD底物溶液100μL,37℃ 30min.
A5.6 加入2mol/L H2SO450μL,终止反应。
A5.7 测各孔OD490。
A5.8 对照设置和结果判定:每板设阳性对照一孔(5~10μg/mL抗原100μL),阴性血清对照三孔,以阴性对照OD均值+3SD为阳性临界值。
A6 循环免疫复合物检测
A6.1 用0.01mol/L pH8.4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7%溶液,取此液100μL加等量1∶2待检血清混合置室温下1h后,3000r/min离心1h。
A6.2 吸去上清液,在沉淀中加含有8mol/L尿素的0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液0.5mL,溶解沉淀物。
A6.3 用此液包被酶标板每孔100μL,每份标本包被两孔,4℃过夜后,洗板3次(阳性及阴性对照同样处理)。
A6.4 每孔加含有10%小牛血清的PBS-T100μL,37℃封板1h,洗板3次。
A6.5 加入工作浓度HRP标记的抗包虫单克隆抗体100μL,37℃下1h后洗板3次。
A6.6 加OPD底物100μL,37℃下30min.
A6.7 加入2mol/L H2SO450μL终止反应。
A6.8 测各孔OD490。
A6.9 对照设置和结果判定:每板设阳性对照一孔(同6.8项),阴性血清对照三孔,以阴性对照OD均值十3SD为阳性临界值。
A7 泡型包虫病特异性EITB技术
A7.1 抗原膜条制备及免疫印渍试验
A7.1.1 收取人工感染多房棘球蚴的长爪砂鼠腹腔中的包囊,剪碎后收集原头节,反复洗涤后,用去氧胆酸钠溶液溶解并抽提后,用PBS透析,收集抗原,测定蛋白质含量并调整至2mg/mL浓度。
A7.1.2 用12%或20%浓度聚丙烯酰胺凝胶或8%~16%梯度胶(厚1.5mm)按常规进行SDSPAGE电泳。在长度为6cm的胶上每一大孔加蛋白质400μg.电泳后按常规转移至硝酸纤维膜上(孔径0.45μm)。然后切成膜条,进行免疫印渍试验。待检血清稀释1∶50。
A7.2 结果解释:在分子量为18KD位置出现酶免疫染色条带者为阳性。