钩端螺旋体病的病原学和血清学诊断方法
A1 钩端螺旋体直接镜检和分离
A1.1 病人血液的直接镜检
A1.1.1 取早期病人血液一滴，加蒸馏水一滴，使血细胞溶解，在暗视野显微镜下检查有否活动的钩端螺旋体。
A1.1.2 取早期病人静脉血1～2mL于无菌试管中待凝固。离心沉淀，吸取血清与血细胞交界处略显白色的悬液。涂片后暗视野显微镜检查有否活动的钩端螺旋体。
A1.1.3 差速离心暗视野检查法：采集早期病人静脉血1mL，加于含2mL枸橼酸钠盐水管中。1000r/min离心10min，吸上层血浆置另一清洁管中，3000～3500r/min离心30～60min.弃上清，取沉淀物一滴于玻片上，暗视野显微镜检查有否活动的钩端螺旋体。
A1.2 培养分离病原体
A1.2.1 病人血液、尿液培养：采集早期病人血液，无菌操作接种于2～3管Korthof培养基中，每管接种1～3滴。血培养管置28℃培养。每隔5～7d取培养物暗视野显微镜下观察有无钩端螺旋体生长，若有生长，即为分离阳性。若未见生长，需继续培养60d，仍不见钩端螺旋体方作阴性处理。
接取病后两周以上的病人中段尿30～50mL于无菌离心管中3500～4000r/min离心1h.取沉渣0.3～0.5mL接种于2～4管上述培养基中，28℃孵育。每隔5～7d取材镜检。为提高检出率和减少污染，可在采集尿标本的前一天晚上给病人服碳酸氢钠（NaHCO3）2～4g，同时，在培养基中加入100～400μg/mL5－氟脲嘧啶或1/2000的磺胺嘧啶。
A1.2.2 病人血液、尿液接种金黄地鼠或幼龄豚鼠（体重120～140g之间）。
A1.2.3 菌株分群，分型鉴定：应用分群血清与新分离的钩端螺旋体作凝集试验，确定菌群。应用交叉凝集素吸收试验或分型因子血清来确定菌型。
A2 钩端螺旋体核酸的检测
利用聚合酶链反应和分子杂交技术检测钩端螺旋体核酸。
A3 血清学诊断方法
A3.1 显微镜凝集试验（MAT）
A3.1.1 抗原的选择和制备：将我国15群15型钩端螺旋体代表株于Korthof或Tepck ии培养基中，28℃培养5～7d，暗视野显微镜检查，每400倍视野下不少于50条，运动活泼并无自凝者可作显凝抗原。
A3.1.2 操作方法：病人血清56℃水浴灭活30min后，用生理盐水以1∶50（早期病人血清）或1∶100（恢复期）和1∶500两个稀释度作定性试验：两个稀释度血清以及作对照用的生理盐水各取50μL，取15个代表株的培养液依次加入每列的三个孔中。摇匀后37℃孵育1.5～2h.用接种环挑取反应液及对照，放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况。若1∶100和1∶500稀释血清与某一群钩端螺旋体抗原发生凝集，需进一步稀释该血清与该群钩端螺旋体抗原凝集，以测定其凝集滴度。凝集滴度按原血清稀释倍数×2计算。
A3.1.3 终点凝集滴度的判定：以出现＋＋凝集（即视野中50％钩体凝集）的血清最高稀释度作为终点凝集滴度。
A3.2 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）
将超声波抗原包被于聚苯乙烯微量反应板。然后，依次结合待测抗体（第一抗体）和酶标抗体（第二抗体）。显色后，测读492nm处的OD值，待测标本OD值超过阴性标本2.1倍者可判为阳性。
A3.3 斑点酶联免疫吸附试验（Dot－ELISA）
将超声波抗原包被于φ45μm的硝酸纤维膜，以下步骤与间接ELISA相同，过氧化氢－四氯－萘酚为底物有蓝色斑点者为阳性，无蓝色为阴性。以血清最高稀释度出现阳性者为滴度判定终点。病人血清滴度大于等于1∶20或双份血清滴度呈4倍增长者有诊断意义。
A4 培养基制备方法
A4.1 Korthof培养基成分和制备方法
A4.1.1 成分
蛋白胨（可用胰蛋白胨代替） 400mg
氯化钠（NaCl） 700mg
氯化钾（KCl） 20mg
碳酸氢钠（NaHCO3） 10mg
磷酸二氢钾（KH2PO4） 120mg
碳酸氢二钠（12个结晶水）（Na2HPO4·12H2O）
氯化钙（CaCl2） 20mg（如高压灭菌或煮沸后出沉淀，可省去此成分）
蒸馏水 500mL
A4.1.2 制法
A4.1.2.1 将以上成分溶于蒸馏水中煮沸20min过滤，校正pH为7.2，分装于烧瓶内，每瓶100mL，15磅30min高压灭菌。
A4.1.2.2 兔血清56℃30min灭活。
A4.1.2.3 将A4.1.2.1液以无菌操作加入灭活兔血清最后浓度为8％～10％。
A4.2 Tepck ии培养基（磷酸盐缓冲溶液）成分和制备方法
母液 1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O 12g/500mL蒸馏水
磷酸缓冲液 1/15 mol/L KH2PO4 4.5g/500mL蒸馏水
取1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O 80mL、1/15 mol/L KH2PO4 20mL，混匀，调整pH7.2～7.4，加入蒸馏水900mL混匀，分装入试管，并用15磅30min高压灭菌，再以无菌操作加入灭活兔血清最后浓度为8％～10％。
