布鲁氏菌病诊断的特异性实验室检查技术（补充件）
A1 从可疑布病患者分离布鲁氏菌
A1.1 血培养
A1.1.1 双相培养基培养：无菌从可疑病人静脉取血液4～5mL，在酒精灯火焰附近将血液注入5～6支含双相培养基的中试管内，或2～4只含双相培基烧瓶中，轻轻混合倾斜，使被检血液分布在琼脂斜面上，置37℃温箱培养，如果怀疑病人是牛种布鲁氏菌感染时，应有一半标本置CO2环境中培养，三天后观察结果，如未见布氏菌生长，可按上法再倾斜，使血液涂在琼脂斜面上，继续培养，每隔一天观察一次，如有可疑布鲁氏菌落，可用铂金耳勾出接种到琼脂试管培基，获得纯培养，进一步作布氏菌鉴定，血培养二十天仍不出菌，可定为阴性。
A1.1.2 接种未受精鸡卵法：取新鲜鸡蛋两个，把鸡蛋放在固定架上，锐端向上，以碘酒和酒精依次消毒蛋壳，用眼科手术刀在顶部穿一小孔，用三厘米长注射针头将被检血液徐徐注入卵黄中，每个鸡蛋接种血液0.2mL，立即用灭菌石蜡将孔密封，置37℃温箱中培养，五天后把接种血液的鸡蛋无菌打开，用灭菌的毛细管把接种血液部分的卵黄及蛋清吸出0.5～0.6mL，接种2～3支斜面培养基上，置37℃培养，2～3天观察一次，15天仍不见可疑菌落生长，定为阴性。
A1.2 骨髓培养
用灭菌的导尿管将尿液导出放入灭菌容器中，为浓缩细菌，提高检出率，可在尿液中加入1％～3％的高价布鲁氏菌免疫血清，混合后，置37℃温箱2h，高速离心沉淀，取沉淀物0.5mL接种在选择性培基上培养，或注射豚鼠，用生物学法分离布鲁氏菌。
A1.3 其他病原材料培养
由乳，脑脊液，关节液和滑囊液分离布鲁氏菌，将液体标本无菌地接种到琼脂斜面上，或培养平板上，涂布于培基表面，参照血培养法观察结果，15天仍无可疑菌生长，定为阴性。
A1.4 生物学分离布鲁氏菌法
为了提高对布鲁氏菌的检出率和从污染的材料中分离布鲁氏菌，将被检材料（固体标本加灭菌的生理盐水研碾成浆液态）经皮下或腹腔注射豚鼠或小白鼠，豚鼠接种1mL，小鼠接种0.5mL，接种豚鼠，即可观察血清变态反应情况，又可作细菌分离培养，小鼠感染后二十天解剖取脏器培养，豚鼠接种后三十天解剖取脏器培养。
A2 特异性血清学检查
A2.1 平板凝集试验（PAT）
A2.1.1 器材及试剂
赫德逊氏凹玻板或一块清洁无油脂玻璃板，平板凝集抗原，被检血清，已知阴性和阳性血清，0.1mL吸管或微量加样器，牙签或细铁丝。
A2.1.2 操作方法
A2.1.2.1 备方形洁净的玻璃板，划成25个方格（或更多），横数5格，纵数5格，第一列各格写下血清号码。
A2.1.2.2 用0.1mL吸管按下列剂量加受检血清于任何一行（横格）的各格中：第一格0.08mL，第二格0.04mL，第三格0.02mL，第四格0.01mL。
A2.1.2.3 加平板凝集抗原0.03mL于各血清格中，用牙签或细铁丝混合，由血清量最小的格混起，每份血清用一根牙签混合即可，用后烧毁，若用细铁丝混合时，每份血清混合后用酒精棉球擦净，然后再用作另一份血清。
A2.1.2.4 混匀后将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温，使其达到30℃左右，5min内记录反应结果。
A2.1.2.5 每次试验用阴、阳性血清各1份作对照。
A2.1.2.6 按下列标准用加号记录反应强度：
＋＋＋＋：出现大的凝集片或小的粒状物，液体完全透明，100％凝集。
＋＋＋：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，75％凝集。
＋＋：有可见的凝集片，液体不甚透明，50％凝集。
＋：液体混浊，只有少量粒状物，25％凝集。
－：液体均匀混浊。
A2.1.2.7 平板凝集反应与试管凝集反应的关系：
0.08mL 血清量出现凝集相当于试管法1∶25的血清稀释度，0.04mL相当于1∶50，0.02mL相当于1∶100，0.01mL相当于1∶200。
A2.1.3 判定
人血清0.02mL出现＋＋及以上凝集程度判为阳性，人血清0.04mL出现＋＋及以上凝集程度判为可疑。
A2.2 虎红平板凝集试验（RBPT）
A2.2.1 器材及试剂
清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1mL吸管或微量加样器，牙签或细铁丝，虎红平板凝集抗原，被检血清。
A2.2.2 操作方法
在玻片上加0.03mL被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03mL，摇匀或用牙签混匀，在5min内判定结果。
A2.2.3 判定
判定凝集程度（－至＋＋＋＋）同平板凝集反应亦可只分为（＋）阳性，（－）阴性两类。
A2.3 试管凝集试验（SAT）
A2.3.1 器材及试剂
试管凝集抗原，被检血清，0.5％的石碳酸生理盐水，吸管，凝集试管，温箱和试管架等。
A2.3.2 操作方法
A2.3.2.1 被检血清的稀释：在一般情况下，每份血清用5支小试管（口径8～10mm），第一管加入2.3mL石碳酸生理盐水，第二试管不加，第三、四、五管各加0.5mL，用1mL吸管吸取被检血清0.2mL，加入第一管中，混匀。混匀后，以该吸管吸取第一管中血清加入第二管和第三管各0.5mL，以该吸管将第三管混匀，并吸取0.5mL加入第四管，混匀。再从第四管吸取0.5mL，弃去。如此稀释后，从第二管到第五管血清稀释度分别为1∶12.5，1∶25，1∶50和1∶100。
A2.3.2.2 加入抗原：先以0.5％石碳酸生理盐水将抗原原液作适当稀释（一般是作1∶10稀释）。稀释后的抗原加入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对照），每管加0.5mL，混匀。加入抗原后，每管总量1mL，血清稀释度从第二管至第五管分别为1∶25，1∶50，1∶100和1∶200，从第一管再吸出0.5mL，剩1mL。
A2.3.2.3 对照：阴性血清对照，血清稀释后加抗原（与被检血清对照相似）。阳性血清对照，其血清稀释到原有滴度，再加抗原，抗原对照，适当稀释的抗原加石碳酸盐水。
A2.3.3 判定
A2.3.3.1 判定比浊管制备：每次试验须配制比浊管作为判定的依据。配制方法是：取本次试验用的抗原稀释液5～10mL，加入等量的0.5％碳酸盐水作倍比稀释，按表A1配制比浊管。
A2.3.3.2 全部试验管，对照管及比浊管充分振荡后置37℃温箱中20～22h，取出后放室温2h，然后以比浊管为标准判定结果。
A2.3.3.3 记录结果：根据各管中上层液体的清亮度记录结果。特别是50％清亮度（＋＋）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。
＋＋＋＋：完全凝集，上层液100％清亮。＋＋＋：几乎完全凝集，上层液75％清亮。＋＋：显著凝集，液体50％清亮。＋：有微量凝集，液体25％清亮。－：无凝集，液体不清亮。
确定每份血清滴度是以出现十十及以上的凝集现象的最高血清稀释度。
A2.4 抗人免疫球蛋白试验（COOMBS）
A2.4.1 器材及试剂
除试管凝集试验所需的一般器材及试剂外，还需抗人免疫球蛋白血清及普通离心机。
A2.4.2 操作方法
A2.4.2.1 试管凝集试验阶段：按A2.3进行试管凝集试验。
A2.4.2.2 抗免疫球蛋白的反应阶段：选取试管凝集试验的可疑反应管及全部阴性反应管，记录管号，经4000r/min离心15min，用生理盐水反复洗涤三次，然后向各管中加入生理盐水0.5mL、一定稀释度（一般是1∶20倍稀释）的抗人免疫球蛋白血清，混匀，将反应管置37℃温箱中20～22h，取出放室温2h后判定结果。
A2.4.2.3 判定：判定结果的标准，程度均同试管凝集试验。
A2.5 补体结合试验（CFT）
A2.5.1 器材及试剂
37℃水浴箱，普通离心机，普通冰箱，各种容量的吸管，烧瓶，凝集管和试管架，生理盐水，补体（新鲜豚鼠血清，或冻干补体），2％的绵羊红细胞悬液，溶血素，补体结合抗原，阴性和阳性血清，被检血清。
A2.5.2 操作方法
A2.5.2.1 补体滴度：在进行CFT时，必须当天滴定补体，将补体用生理盐水稀释为1∶20，通常在十支凝集管中分别依次加入不同量的1∶20稀释补体0.02～0.2mL，然后各管中加入2个单位的抗原液0.2mL，再用生理盐水把各管补至0.6mL，混匀后放37℃水浴中30min，再加0.2mL的溶血素（2个单位）和2％红细胞0.2mL，混匀，置37℃水浴中30min，判定结果。
上例中产生完全溶血且合补体量最少管为第八管，定为一个恰定单位，前一管（即第七管）为一个完全单位。在正式试验时采用两个完全单位的补体量，按式（A1）计算出补体稀释倍数X。
20∶2Y＝X∶0.2…… （A1）
式中：Y——1个完全单位补体量。
A2.5.2.2 溶血素及抗原滴定：在进行CFT时溶血素和抗原亦需滴定，但不必在试验当天进行；而且，在购到此二试剂时出售单位（或提供单位）都已滴定了，需用单位按说明稀释即可。
A2.5.2.3 被检血清灭活：人血清灭活补体的温度是56℃，时间为30min。
A2.5.2.4 本试验：灭活后的被检血清从1∶5稀释开始，然后作倍比稀释，每管中稀释血清量为0.2mL，再向各管中加2个单位抗原0.2mL，2个单位补体量0.2mL，混匀，置37℃水浴中30min，取出后，向各管加0.4mL的溶血素，再放37℃水浴中作用30min，判定结果。
A2.5.3 判定
＋＋＋＋：无溶血，SRBC沉于管底或悬浮。＋＋＋∶25％溶血。＋＋∶50％溶血。＋∶75％溶血。－：100％溶血。以50％（＋＋）及以上不溶血确定CFT的滴度。
为防止判定的错误，可配制标准溶血管。
A3 皮肤过敏试验
A3.1 器材及试剂
布鲁氏菌素，75％酒精棉球，结核菌素注射器，皮内注射针头，测量尺。
A3.2 操作方法
于被检者前臂内侧1/3处，用酒精棉球消毒后，晾干，皮内注射0.1mL布鲁氏菌素，在注射后24和48h作两次观察。
A3.3 判定
两次观察，以反应最强的结果为准，注射局部出现充血，浸润为2.0cm×2.0cm及以上（或以反应面积≥4.0cm（上标始）2（上标终）），判为阳性。
